L'uso di Farmacologiche-sfida fMRI in ricerca pre-clinica: Applicazione del sistema 5-HT

Preparazione per l'animale in vivo RMN 1. Incannulamento chirurgico Anestetizzare il ratto (ratti maschi Wistar, 200-300 g) con isoflurano (induzione al 5% e poi ridotto al 1,5-2% per il mantenimento dell'anestesia durante la preparazione degli animali e di scansione), dato in aria medicale (21% O 2, BOC UK) . Assicurarsi che l'animale è ben anestetizzato e non mostra alcun risposta a un pizzico piedi. L'arteria femorale e la vena sono cannulati per il gas del sangue e misurazioni della pressione arteriosa e la somministrazione del farmaco, rispettivamente sfida. Durante la procedura chirurgica, temperatura corporea dell'animale viene monitorata e mantenuta attraverso una sonda rettale e coperta termica (Harvard Apparatus). L'animale anestetizzato è posizionato su un tampone di riscaldamento sotto un microscopio per dissezione in decubito dorsale. Shave metà coscia e tamponare la pelle con alcool. Fai una incisione cutanea due centimetri lungo la piega formata dal addome e coscia destra.Smussa dei muscoli adduttori viene usato per visualizzare l'arteria femorale, e il nervo vena femorale. Separare con cura i vasi. Delicatamente legare una legatura di seta completamente attorno all'estremità distale del vaso e posizionare un altro legame con un mezzo di un nodo chirurgico liberamente nel sito prossimale. Applicare la trazione a entrambe le legature, per occludere il flusso di sangue nella porzione restante metà del recipiente esposto tra le legature. Fare una piccola incisione di circa un terzo della circonferenza nave in questa parte della nave per consentire l'inserimento di una cannula PE-50 (0,54 mm di diametro interno e 0,96 millimetri di diametro esterno in caso di ratti maschi adulti, altrimenti 0,40 mm ID e 0,80 millimetri DE) nel recipiente. La cannula deve essere inserita alcuni mm (almeno 5) nel recipiente. Una volta nel lume, lavare una piccola quantità di soluzione fisiologica eparinizzata (15 UI / ml) attraverso il vaso per evitare la formazione di coaguli di sangue. Il ciclo di seta prossimale è anche legato completamente per fissare la cannula. Ripetere questa procedura per la seconda nave. Incollare la pelle utilizzando un adesivo Vetbond Tissue (3M UK plc, Bracknell, UK), quando entrambe le cannule sono a posto. Vedere la Figura 1 per la collocazione esatta delle cannule. Mettete l'animale in un letto compatibile stereotassica MR (M2M Imaging Corp., USA) in posizione prona. Mantenere la testa dell'animale mediante l'inserimento di barre di auricolari e un bar dente. A questo punto, l'animale può essere nello scanner MRI per l'imaging. L'animale rimane anestetizzato ed è libero di respirazione durante tutta la procedura di imaging intero. 2. Monitoraggio Durante l'intera procedura di imaging, varie risposte fisiologiche devono essere continuamente monitorati ed essere quanto più costante possibile. Ciò è essenziale, dal momento che queste risposte possono variare notevolmente sopra la finestra tempo stesso segnale phMRI e anche influenzare il segnale di interesse. È altresì importante, dato che l'animale viene posto in MAGNet ed è quindi fuori dalla vista e non suscettibili di controlli standard della profondità dell'anestesia (tep per esempio pinch), per garantire un'adeguata profondità dell'anestesia. Inoltre, dato che molti farmaci modificare i parametri cardiovascolari come la pressione sanguigna, la misurazione di questi è fondamentale per garantire possa tener conto di effetti fisiologici a livello mondiale di azione del farmaco nei dati phMRI. Vedere anche la sezione 4 per i valori di base e le risposte attese alla infusione di 5 mg / kg fluoxetina. La temperatura corporea viene mantenuta a 37 ± 1,5 ° C da un sistema di riscaldamento ad aria calda (SA Instruments, New York, USA). Siate consapevoli del fatto che la RM possono influenzare la misurazione della temperatura, verificare con il vostro sistema. Monitorare e registrare frequenza respiratoria dell'animale utilizzando un bracciale respiratorio accoppiato al sensore di pressione (SA Instruments, New York, USA). Registrare invasiva della pressione arteriosa mediante un trasduttore di pressione (TSD104A, BIOPAC Systems Corp., USA) e periodicamente ritirare unad analizzare campioni di gas nel sangue arterioso (RapidLab, Siemens diagnostica) attraverso l'arteria femorale cannulata durante l'imaging di monitorare pCO 2 arteriosa e la pressione parziale di ossigeno (pO 2). Utilizzare la vena femorale cannulata come la linea di infusione principale per la sfida farmacologica (fluoxetina (fluoxetina cloridrato da Sigma-Aldrich, UK) soluzione, 5 mg / kg, disciolto in soluzione fisiologica). In vivo imaging Una rappresentazione schematica della configurazione fMRI sperimentale è data in Figura 2. 3. Parametri di imaging Una volta che l'animale viene posto all'interno dello scanner e continua a mostrare stabili risposte fisiologiche, l'imaging può iniziare. Nei nostri studi, abbiamo usato un piccolo sistema 4,7 T animale MRI (Agilent Technologies) con una quadratura cilindrico di trasmissione / ricezione bobina RF con 72 mm di diametro interno (M2M Imaging Corp., USA). Creare un immagine tre esploratore aereo per p correttamenteOSIZIONE il cervello al centro del campo di vista MRI e utilizzare la correzione localizzata spessore (sequenza fastmap) per migliorare l'omogeneità del campo magnetico nel cervello. Per ogni animale, in primo luogo acquisire una pesata in T2 immagine anatomica del volume ai fini della registrazione e segmentazione. Abbiamo usato una sequenza turbo spin echo con la lunghezza del treno echo = 8; dimensione della matrice = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm 2, con l'acquisizione interleaved di 30 fette contigue coronali con spessore di 1 mm, centrato 8 millimetri caudale al margine posteriore del bulbo olfattivo; medie = 4; TR / TE = 5112/60 ms. Assicurarsi che l'animale le proprie risposte fisiologiche sono costanti prima di iniziare la scansione phMRI. Per l'acquisizione serie storiche, abbiamo usato lo stesso T2-pesata sequenza turbo spin echo con la lunghezza del treno echo = 16; matrice size = 128 x 128, con l'acquisizione interleaved di 20 fette contigue di 1 mm di spessore centrato stessa posizione; TR / TE = 4915/60 ms. In totale, abbiamo acquisito 32 punti di tempo con un unocquisition tempo di 158 secondi per volume delle serie temporali e un tempo di scansione totale di 84 min. Il primo volume è usato come uno 'scan fittizio' per affrontare gli effetti di saturazione T1 e non utilizzati nell'analisi dei dati. Altre sequenze fMRI come gradiente di eco o echo planar imaging (EPI) sequenze possono anche essere utilizzati. Assicurati di valutare la stabilità del segnale della sequenza di scelta prima dell'inizio dell'esperimento. Acquisire un numero di volumi di base, prima di somministrare il farmaco sfida. Si consiglia almeno 10 minuti di acquisizione al basale in condizioni stabili. Avviare l'infusione in esattamente nello stesso momento per tutti gli animali. Nel nostro protocollo, abbiamo iniziato somministrazione all'inizio del volume 9a (dopo circa 21 min scansione basale). Dopo infusione, l'acquisizione di immagini continuato per altri 60 minuti (32 volumi in totale). Assicurarsi che il post-infusione periodo è sufficientemente lungo per visualizzare le modifiche e raggiungere lo stato stazionario o il recupero del segnale, a seconda della vostra ricerca Questi,su e la vostra scelta di sfida droga. Quando l'acquisizione delle immagini, rimuovere l'animale dallo scanner. Eseguire una finale di misurazione del gas del sangue per garantire la stabilità dei parametri del gas del sangue e per consentire la valutazione degli effetti della droga sulla fisiologia di base. Elaborazione dei dati 4. Le risposte fisiologiche Attesi risposte fisiologiche alla sfida dipendono dal farmaco scelto. Di seguito, i valori di base generalmente accettati (su ratti maschi adulti) e le risposte attese alla infusione endovenosa di 5 mg / kg fluoxetina sono dati. Tasso di respirazione dovrebbe essere stabile a 45-75 respiri al minuto. La sfida farmacologica di fluoxetina induce un aumento breve (15-20%) in frequenza respiratoria. La pressione arteriosa deve essere costante e tra 100-150 mmHg (BIOPAC Systems Corp., Goweta, USA). La sfida fluoxetina induce un calo breve ma ripida di circa il 20% della pressione arteriosa.Questo dovrebbe recuperare entro 5-10 minuti. Ciò è mostrato nella Figura 3. Valori dei gas del sangue deve essere stabile (misura almeno due volte) e nei seguenti intervalli prima di iniziare la scansione phMRI: pCO 2, 35-45 mmHg; pO 2, 80-130 mmHg, pH, 7,35-7,45. Controllare sempre questi valori ancora una volta dopo la scansione per vedere se l'animale è rimasto stabile e consentire la valutazione degli effetti della droga sulla fisiologia di base. Alta pCO 2 valori indurre vasodilatazione e quindi evitare di vedere i cambiamenti del segnale BOLD. Assicurarsi che l'animale è sotto un livello continuo e costante di anestesia (2 ± 0,25%, livelli più elevati può causare la depressione della reattività cerebrovascolare e inferiore anestesia insufficiente e quindi il movimento), prima di iniziare la scansione phMRI e, soprattutto, evitare eventuali rettifiche regime di anestesia (ad esempio% isoflurano e / o il flusso di gas) durante l'acquisizione dell'immagine funzionale in quanto ciò potrebbe anche influenzare il segnale BOLD. <p class = "jove_title"> 5. Pre-elaborazione dei dati MRI Qui si descrive diverse fasi della pre-elaborazione dei dati di RM, al fine di optimalize i dati per l'analisi statistica. Citiamo gli strumenti che vengono utilizzati nel nostro laboratorio, tuttavia molti strumenti differenti sono disponibili. 5,1 preparazione dei dati Mettere le crude immagini nel formato di file corretto per il software di analisi MRI che si preferisce utilizzare (o NIfTI1.1 Analyze7.5 formato per i programmi FSL). Diversi programmi gratuiti di conversione dei file sono disponibili online. Secondo lo scanner utilizzato, potrebbe essere necessario costruire prima un 3D (scansione anatomica) o 4D (phMRI scan) immagine di tutte le porzioni distinte 2D. Ciò può essere fatto utilizzando un programma di elaborazione di immagini, come ImageJ 1. Al fine di garantire la compatibilità con algoritmi di analisi progettate per l'utilizzo con i dati umani (per esempio programmi FSL), dimensione del voxel deve essere moltiplicato per un fattore 10 (questo può essere fatto anche utilizzando ad esempio ImageJ). Nel nostro studio, ciò ha portato in una dimensione voxel di 3,91 x 3,91 x 10 mm 3. Controllare visivamente le vostre immagini per le irregolarità di orientamento, manufatti, e movimento. Fare attenzione a non utilizzare le scansioni con manufatti in chiaro o con un movimento eccessivo nelle tue analisi in quanto vi distorcere i risultati. L'orientamento di tutte le scansioni dovrebbero essere simili tra le immagini anatomiche e funzionali e in armonia con il cervello di riferimento utilizzato. Nel nostro studio, abbiamo utilizzato il modello di cervello di ratto stereotassica descritto da Schwarz 14. La FSL fslswapdim comando può essere utilizzato per il riorientamento. 5,2 movimento di correzione Per correggere eventuali artefatti da movimento nelle serie temporali 4D, abbiamo usato la correzione McFlirt movimento dell'utensile (correzione del movimento utilizzando FMRIB è lineare strumento di registrazione immagine, parte della Biblioteca del Software FMRIB, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). MCFLIRT è un movimento intra-modale correzione utensile designed per l'utilizzo su serie temporali fMRI e basato sulla ottimizzazione e tecniche di registrazione utilizzate in FLIRT, uno strumento completamente automatizzato per la lineare (affine) intermodale di registrazione di immagini del cervello. Sempre controllare in seguito se il risultato è soddisfacente. 5,3 cervello segmentazione Elimina tutto non-tessuto cerebrale da un'immagine dell'intera testa sia per la serie temporale 4D come immagine anatomica 3D. Per questo abbiamo usato il BET strumento FSL (Brain Strumento di estrazione v 2.1, parte della Biblioteca del Software FMRIB, www.fmrib.ox.ac.uk / FSL ). Le impostazioni predefinite sono sviluppati per l'utilizzo con cervelli umani e non sono pertanto ideali per cervello di ratto. Abbiamo usato i seguenti parametri: soglia d'intensità frazionaria, f = 1.0, gradiente verticale in soglia d'intensità frazionale, g = 0,1; raggio e la testa (in mm), r = 175 per la maggior parte degli animali. Se necessario, è possibile ottimizzare questi valori per ogni soggetto. 6. Dati l'analisi dells Obiettivo dell'analisi statistica dei dati MR è quello di determinare i voxel che presentano varianza aggiuntiva imputabile alla sfida della droga in modo statisticamente robusto. Diversi approcci metodologici sono disponibili per questo, anche se i pacchetti software numerabili. La scelta effettuata è dipendente dalla disponibilità di software e della conoscenza / esperienza al vostro laboratorio e la domanda di ricerca specifica. Qui diamo un metodo suggerito come viene utilizzato nel nostro laboratorio. 6,1 Prima di analizzare i dati MRI, determinare un modello lineare generale (GLM) a cui i dati verranno montati. Questo può essere un semplice quadrato modello on-off (spento per pre-farmaco e di post-infusione farmaco) o un modello specifico sulla base dei dati. Abbiamo utilizzato il programma Stimolare 21 per stabilire, basata su dati del modello GLM. Eseguire due campioni T-test (ad esempio in stimolare) su tutti i volumi di base vs tutti post-challenge volumi. Facoltativamente, lasciare out il primo volume (s) e il volume in cui viene data la sfida, poiché quelli non può rappresentare stato stazionario di imaging. Successivamente, discriminare tutti i voxel con più di una certa variazione% rispetto al basale. Abbiamo usato tutti i voxel con più di 1% di variazione. Successivamente, l'andamento temporale media in tutti questi voxel, che dà già un'idea della forma del modello. In questo modo si può determinare se la sfida 1) ha un effetto immediato o ritardato, 2) se e quando l'effetto raggiunge un plateau e / o di picco e, 3) se e quando l'effetto declina nuovamente nel corso del tempo scansione. Esempi sono mostrati in Figura 4A e 4B. 6,2 Il passo successivo è quindi quello di verificare statisticamente la prima serie di immagini in tempo 4D di ogni animale contro il precedente modello GLM stabilito. Per questo, abbiamo usato il programma FEAT FSL (FMRI Strumento di analisi di esperti, v5.98) 17,24. Tuttavia, altri strumenti di analisi fMRI sono dispobile pure. All'interno dello strumento di analisi, un'analisi di primo livello deve essere istituito. Ciò richiede i seguenti passaggi: Assicurarsi di utilizzare le stesse impostazioni per ogni animale. Si può scegliere di eliminare i primi (due) volumi prima dell'analisi, dal momento che allo stato stazionario di imaging non può essere ancora raggiunto in quel punto. Impostare il TR, questo è il tempo (in secondi) tra l'inizio di ogni volume successivo. Dal momento che stai vedendo gli effetti che potrebbe durare per tutto il tempo di scansione, non c'è bisogno di impostare un filtro passa-alto o basso. Spazialmente lisciare i dati al fine di ridurre il rumore e migliorare il rapporto segnale-rumore (SNR) rapporto. Abbiamo scelto un kernel FWHM di 8 mm. Ora lanciate il modello GLM desiderato sui vostri dati. Questo è il tuo principale variabile esplicativa (EV), cioè la forma d'onda che si sta testando i vostri dati contro. La GLM che è stato determinato sulla base dei propri dati può essere visto in Figura 4C. Vi è anche la possibilità di aggiungere ulteriori confondere EV come parametri di movimentazione,frequenza del rumore a bassa (drift scanner) o addirittura i parametri fisiologici come la pressione per rimuovere generali fisiologici droga effetti. All'interno FEAT: uso FILM prewhitening. Aggiungere derivata temporale. Nella scheda Contrasti & F-test, ha istituito un contrasto. Per convertire una singola EV in un'immagine statistica Z, impostare il valore di contrasto a 1. Questo vi dà tutti i voxel in cui suo sviluppo nel tempo possono essere spiegati in modo significativo dal GLM. Impostando il valore a -1 darà l'attivazione negativo. Dopo aver eseguito il test statistico iniziale, l'immagine risultante statistica deve essere thresholded per mostrare che voxel o cluster di voxel vengono attivati ​​ad un livello di significatività particolare. Multipla correzione confronto è necessaria a causa del gran numero di voxel cerebrali testati. Il programma FEAT FSL utilizza un sistema automatico di correzione cluster-based multiple confronto basato sulla (Field casuale gaussiana) teoria GRF 25. Infine, i dati devono essere spazialmente normalizzato a un'immagine di riferimento, al fine di eseguire statistiche del gruppo. Prima registrare i dati funzionali agli animali cervello-estratto di immagine anatomica e poi l'immagine di riferimento. Abbiamo utilizzato il modello stereotassica cervello di ratto descritto da Schwarz 14 come riferimento cervello. Dopo questo, gli primo livello analisi di tutti gli animali possono essere combinati in di livello superiore (gruppo) analisi statistiche. Questo è strettamente dipendente al proprio disegno dello studio proprio e domande di ricerca. 6,3 Dopo questo, gli primo livello analisi di tutti gli animali possono essere combinati in di livello superiore (gruppo) analisi statistiche. Questo è strettamente dipendente al proprio disegno dello studio proprio e domande di ricerca. 6,4 Risposte farmacologiche fisiologici possono essere accoppiati o correlato al segnale MR, se desiderato. Vedere anche la sezione 6.2.3 sull'aggiunta di confondere EV. 7. Risultati rappresentativi ove_content "> Quando il farmaco stimolante (5 mg / kg iv fluoxetina) entra nel sistema vascolare, una risposta chiara fisiologico indicato dovrebbe essere visibile nella frequenza respiratoria (up) e la pressione sanguigna (in basso). Queste risposte normalizzarsi in media entro 5-10 minuti . In figura 3 la caduta della pressione sanguigna è chiaramente visibile. La media andamento nel tempo del segnale dovrebbe mostrare una linea di base relativamente stabile e un chiaro effetto della sfida. Preferibilmente, non ci dovrebbe essere sfida-indipendente deriva nel segnale. Un esempio rappresentativo di un corso di tempo medio di segnale può essere visto in figura 5A. Artefatti, quali depressione respirazione / guasto o modifiche anestesia sono spesso chiaramente visibili nel segnale. La depressione respiratoria influenzerà negativamente il segnale in tutto il cervello. Questo può essere visto in Figura 5B. Dopo analisi primo livello, il pattern di attivazione dovrebbe essere principalmente positivo e locaTed in regioni determinate solo (cioè aree della corteccia, ippocampo, ipotalamo ed il talamo, vedi Figura 6A). Se l'intero cervello è disattivato, questo è spesso un'indicazione di anestesia troppo profonda e / o carenza di ossigeno durante la scansione. Un esempio di questo può essere visto in Figura 6B. Figura 1. Posizione di posizionamento delle cannule nell'arteria femorale e vena. Figura 2 Rappresentazione schematica della configurazione MRI;. Tutta l'apparecchiatura deve essere non ferromagnetico ed è collegato ad un sistema modulare che permette l'acquisizione di immagini gated evitando interferenze da moto dovuto alla respirazione e / o battito cardiaco. La temperatura corporea viene regolata tramite un modulo di riscaldamento per monitorare e controllare la temperatura degli animali durante l'imaging. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita . Figura 3. Esempio rappresentativo di dati di pressione del sangue. Vi è una netta diminuzione della pressione sanguigna visibile direttamente dopo l'inizio dell'infusione (barra rossa). I valori normali sono raggiunti nuovamente entro 10 min. dopo la somministrazione sfida. Figura 4. A) pattern di attivazione prevista utilizzando il programma di analisi MRI Stimolare (il rosso è l'attivazione positiva, il blu è l'attivazione negativo). B) Corso Tempo medio di tutti i voxel attivati ​​(variazione ≥ 1% rispetto al basale) in tutti gli animali. C) Esempio del modello GLM con conseguente FSL / FEAT. Click qui per ingrandire la figura. Figura 5. Esempio di attivazione positivo. Il corso del tempo nel voxel attivati ​​(rosso) segue approssimativamente la forma del modello GLM. L'infusione del farmaco iniziata attorno al punto di tempo 8. Esempio di attivazione negativa in intero cervello dopo anestesia troppo profonda. Il corso di tempo dei voxel negativamente attivati ​​(blu) mostrano un calo generale del segnale e nessun effetto della sfida è visibile. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 6. Prevista pattern di attivazione dopo l'analisi di primo livello. Attivazione di gruppi di voxel (rosso yEllow), solo in specifiche aree cerebrali. Esempio di pattern 'cattivo' attivazione. Attivazione cervello intero negativo (blu) nello stesso animale come in figura 5B.