L'utilisation de l'IRMf pharmacologique-défi en recherche pré-clinique: Application à la System 5-HT

Préparation des animaux in vivo pour l'IRM 1. Canulation chirurgicale Anesthésier le rat (rat mâle Wistar, 200-300 g) avec de l'isoflurane (induction de 5%, puis réduits à 1,5-2% pour l'entretien de l'anesthésie lors de la préparation des animaux et de numérisation) donnée dans l'air médical (21% de O 2, BOC au Royaume-Uni) . Assurez-vous que l'animal est bien anesthésié et ne présente pas de réponse à une pincement de l'orteil. L'artère et la veine fémorales sont canulées pour gaz du sang et de mesures de pression artérielle et l'administration du médicament défi respectivement. Au cours de la procédure chirurgicale, la température du corps de l'animal est contrôlé et maintenu par une sonde rectale et une couverture thermique (Harvard Apparatus). L'animal anesthésié est placé sur un coussin chauffant sous un microscope à dissection en décubitus dorsal. Rasez la zone mi-cuisse et nettoyer la peau avec de l'alcool. Faire une incision de 2 cm la peau le long du pli formé par l'abdomen et la cuisse droite.Dissection des muscles adducteurs est utilisé pour visualiser l'artère fémorale, la veine et le nerf fémoral. Séparer soigneusement les vaisseaux. Doucement lier une ligature de soie complètement autour de l'extrémité distale de la cuve et placer un autre lien avec la moitié d'un noeud chirurgical de manière lâche dans le site proximale. Appliquer une traction à deux ligatures, pour occlure le flux sanguin dans la partie médiane du navire restante exposée entre les ligatures. Faire une petite incision d'environ un tiers de la circonférence navire dans cette partie du navire pour permettre l'insertion d'une canule PE-50 (0,54 mm de diamètre interne et 0.96mm pour un diamètre externe en cas de rats mâles adultes, sinon 0,40 mm de diamètre et 0,80 mm ED) dans le récipient. La canule doit être inséré plusieurs mm (au moins 5) dans le récipient. Une fois dans la lumière, rincer une petite quantité de sérum physiologique hépariné (15 UI / ml) à travers la cuve pour éviter toute formation de caillot de sang. La boucle de soie proximale est également ligaturé complètement pour fixer la canule. Répéter cette procédure pour le deuxième navire. Collez la peau à l'aide d'un adhésif tissulaire Vetbond (3M UK plc, Bracknell, Royaume-Uni) lorsque les deux canules sont en place. Voir Figure 1 pour le placement exact des canules. Placez l'animal dans un lit MR stéréotaxique compatible (m2m Imaging Corp, USA) dans une position couchée. Maintenir la tête de l'animal par l'insertion de barres d'oreilles et un bar de la dent. À ce stade, l'animal peut être placé dans le scanner IRM pour l'imagerie. L'animal reste anesthésié et est libre respiration au cours de la procédure d'imagerie. 2. Surveillance Au cours de la procédure d'imagerie tout entier, plusieurs réponses physiologiques doivent être constamment surveillés et être maintenue aussi constante que possible. Cela est essentiel, étant donné que ces réponses peuvent varier considérablement au cours de la fenêtre en même temps que le signal phMRI et affectent également le signal d'intérêt. Il est également important, étant donné que l'animal sera placé dans la MAgnet et est donc hors de la vue et ne se prêtent pas à des contrôles standards de profondeur de l'anesthésie (pincement de l'orteil, par exemple), pour assurer convenablement la profondeur de l'anesthésie. En outre, étant donné que de nombreux médicaments modifient les paramètres cardiovasculaires comme l'hypertension artérielle, la mesure de ceux-ci est essentielle pour assurer peut être tenu compte des effets globaux physiologiques de l'action du médicament dans les données phMRI. Voir aussi la section 4 pour les valeurs de référence et les réponses attendues à la perfusion de 5 mg / kg de fluoxétine. La température corporelle est maintenue à 37 ± 1,5 ° C par un système de chauffage à air chaud (SA Instruments, New York, USA). Soyez conscient du fait que l'IRM peut affecter la mesure de température, vérifier auprès de votre propre système. Surveiller et enregistrer le taux de respiration de l'animal à l'aide d'un brassard respiratoire couplé au capteur de pression (SA Instruments, New York, USA). Enregistrez invasive de la pression artérielle en utilisant un capteur de pression (TSD104A, Systèmes Corp Biopac, USA) et retirer périodiquement uneseriez analyser les échantillons de gaz sanguins artériels (Rapidlab, Siemens diagnostique) via l'artère fémorale perforé lors de l'imagerie à surveiller pCO 2 artérielle et la pression partielle d'oxygène (pO 2). Utilisez la veine fémorale perforée que la ligne de perfusion principal de la provocation pharmacologique (fluoxétine (chlorhydrate de fluoxétine chez Sigma-Aldrich, Royaume-Uni) en solution, 5 mg / kg, dissous dans une solution saline). L'imagerie in vivo Une représentation schématique de l'installation expérimentale IRMf est donné dans la figure 2. 3. Paramètres d'imagerie Une fois que l'animal est placé à l'intérieur du scanner et continue de montrer stables réactions physiologiques, l'imagerie peut commencer. Dans nos études, nous avons utilisé une hausse de 4,7 T pour petits animaux système d'IRM (Agilent Technologies) avec une quadrature cylindrique d'émission / réception bobine RF avec 72 mm de diamètre intérieur (m2m Imaging Corp, USA). Faire une image avion trois éclaireur correctement position du cerveau dans le milieu du champ de vue et de l'IRM utiliser la correction cale localisée (séquence FastMap) pour améliorer l'homogénéité du champ magnétique dans le cerveau. Pour chaque animal, d'abord acquérir un volume pondérée en T2 image anatomique des fins d'enregistrement et de la segmentation. Nous avons utilisé une séquence turbo spin écho avec la longueur du train d'écho = 8; taille de la matrice = 256 x 256; FOV = 50 x 50 mm 2, avec l'acquisition entrelacée de 30 coupes coronales contiguës avec 1 mm d'épaisseur, centrée 8 mm caudale au bord postérieur du bulbe olfactif; moyennes = 4; TR / TE = 5112/60 ms. Assurez-vous que l'animal de ses réactions physiologiques sont constants avant de commencer l'analyse phMRI. Pour l'acquisition de séries temporelles, nous avons utilisé la même séquence pondérée en T2 turbo spin écho avec la longueur du train d'écho = 16; taille de la matrice = 128 x 128, avec l'acquisition entrelacée de 20 tranches contiguës avec 1 mm d'épaisseur centré à la même position; TR / TE = 4915/60 ms. Au total, nous avons acquis 32 points dans le temps avec un atemps cquisition de 158 sec par volume de séries chronologiques et un temps de balayage total de 84 min. Le premier volume est utilisé comme un «balayage factice» pour contrer les effets de saturation T1 et pas utilisé dans l'analyse des données. Séquences IRMf autres comme en écho de gradient ou l'écho planar imaging (EPI) des séquences peuvent également être utilisés. Assurez-vous d'évaluer la stabilité du signal de votre séquence de choix avant le début de votre expérience. Acquérir un certain nombre de volumes de base, avant d'administrer le médicament défi. Nous suggérons au moins 10 minutes d'acquisition de référence dans des conditions stables. Commencer la perfusion à la même heure pour tous les animaux. Dans notre protocole, nous avons commencé à l'administration au début du volume 9 (après environ 21 min de balayage de base). Après la perfusion, l'acquisition d'images a continué pendant encore 60 minutes (32 volumes au total). Assurez-vous que la période post-perfusion est suffisamment longue pour visualiser les changements et d'atteindre l'état d'équilibre ou de récupération du signal, en fonction de votre questi la rechercheet que votre choix de défi de drogue. Lorsque l'acquisition d'image est terminée, retirez l'animal à partir du scanner. Effectuer une mesure de la tension finale de gaz pour assurer la stabilité des paramètres des gaz du sang et de permettre une évaluation des effets des médicaments sur la physiologie de base. Informatique 4. Les réponses physiologiques Attendus réponses physiologiques à l'défi dépendent de la drogue choisie. Ci-dessous, les valeurs de référence généralement reconnus (des rats mâles adultes) et les réponses attendues à la perfusion iv de 5 mg / kg la fluoxétine sont donnés. Le taux de respiration doit être stable à 45-75 respirations par minute. Le défi pharmacologique de la fluoxétine induit une augmentation à court (15-20%) du taux de respiration. La pression artérielle doit être constante et entre 100-150 mmHg (Systèmes Corp Biopac, Goweta, Etats-Unis). Le défi fluoxétine induit une chute courte mais raide d'environ 20% de la pression artérielle.Cela devrait récupérer dans les 5-10 minutes. Ceci est illustré dans la figure 3. Les valeurs des gaz du sang doit être stable (mesurer au moins deux fois) et dans les plages suivantes avant de commencer l'analyse phMRI: pCO 2, 35-45 mmHg; pO 2, 80-130 mmHg, pH, de 7,35 à 7,45. Toujours vérifier à nouveau ces valeurs après la numérisation pour voir si l'animal est resté stable et de permettre une évaluation des effets des médicaments sur la physiologie de base. Hautes pCO 2 valeurs va induire une vasodilatation et donc éviter de voir les changements signal BOLD. Assurez-vous que l'animal est sous un niveau continu et constant de l'anesthésie (2 ± 0,25%; des niveaux plus élevés peut causer la dépression de la réactivité vasculaire cérébral et inférieures anesthésie insuffisante et donc le mouvement), avant de commencer l'analyse phMRI et, surtout, éviter les éventuels ajustements apportés à la régime de l'anesthésie (par exemple% d'isoflurane et / ou de gaz) lors de l'acquisition de l'image fonctionnelle, car cela pourrait également affecter le signal BOLD. <p class = "jove_title"> 5. Les données de prétraitement IRM Nous décrivons ici les différentes étapes du prétraitement des données de résonance magnétique afin d'optimaliser les données pour l'analyse statistique. Nous mentionnons les outils qui sont utilisés dans notre laboratoire, mais de nombreux outils différents sont disponibles. 5.1 La préparation des données Mettez les images brutes dans le format de fichier correct pour le logiciel d'analyse IRM que vous préférez utiliser (ou NIfTI1.1 Analyze7.5 format pour les programmes de FLS). Plusieurs programmes gratuits de convertisseur de fichiers sont disponibles en ligne. Selon le scanner utilisé, il peut être nécessaire d'abord de construire un 3D (scan anatomique) ou 4D (phMRI scan) l'image de toutes les tranches distinctes 2D. Cela peut être fait en utilisant un programme de traitement d'image, tels que ImageJ 1. Afin d'assurer la compatibilité avec les algorithmes d'analyse conçus pour être utilisés avec les données de l'homme (par exemple les programmes de FLS), taille de voxel doit être multipliée par un facteur 10 (ce qui peut également être fait en utilisant par exemple ImageJ). Dans notre étude, cela s'est traduit par une taille de voxel de 3,91 x 3,91 x 10 mm 3. Contrôler visuellement vos images pour des irrégularités dans l'orientation, des artefacts, et de mouvement. Veillez à ne pas utiliser des scans avec des objets clairs ou de mouvement excessif dans vos analyses, car ils faussent les résultats que vous. Orientation de tous les scans devraient être similaires entre les images anatomiques et fonctionnelles et en concordance avec le cerveau de référence utilisé. Dans notre étude, nous avons utilisé le modèle de rat stéréotaxique du cerveau décrite par Schwarz 14. Le FSL commande fslswapdim peut être utilisé pour réorienter. 5.2 Correction de mouvement Pour corriger les artefacts de mouvement dans la série 4D en temps, nous avons utilisé le McFlirt outil mouvement de correction (correction de mouvement à l'aide de l'outil FMRIB linéaire enregistrement d'image, une partie de la bibliothèque du logiciel de FMRIB, www.fmrib.ox.ac.uk / fsl ). MCFLIRT est un intra-modale mouvement de correction d'outil designed pour une utilisation sur des séries chronologiques et de l'IRMf basée sur l'optimisation et les techniques d'enregistrement utilisés dans FLIRT, un outil entièrement automatisé pour linéaire (affine) inter-modale d'enregistrement d'image du cerveau. Toujours vérifier ensuite si le résultat est satisfaisant. 5,3 segmentation du cerveau Supprimer l'ensemble des tissus non-encéphalique d'une image de toute la tête à la fois pour la série chronologique 4D que l'image anatomique 3D. Pour cela nous avons utilisé l'outil de BET FLS (Brain Extraction Outil version 2.1, partie de la Bibliothèque de logiciels de FMRIB, www.fmrib.ox.ac.uk / fsl ). Les paramètres par défaut sont développés pour une utilisation avec les cerveaux humains et ne sont donc pas idéal pour le cerveau de rat. Nous avons utilisé les paramètres suivants: seuil d'intensité fractionnaire, f = 1,0; gradient vertical dans seuil d'intensité fractionnaire, g = 0.1, et la tête de rayon (en mm), r = 175 pour la plupart des animaux. Si nécessaire, vous pouvez optimiser ces valeurs par sujet. 6. Données Analysis Objectif de l'analyse statistique des données MR est de déterminer les voxels qui présentent variance supplémentaire attribuable à relever le défi de drogue d'une manière statistiquement robuste. Diverses approches méthodologiques sont disponibles pour ce, même sous forme de paquets logiciels innombrables. Le choix que vous faites dépend de la disponibilité des logiciels et des connaissances / expérience à votre laboratoire et votre question de recherche spécifique. Ici, nous donnons une méthode suggérée que celle utilisée dans notre laboratoire. 6.1 Avant d'analyser les données de l'IRM, de déterminer un modèle linéaire général (GLM) à laquelle les données seront équipés. Cela peut être une simple carré de marche-arrêt modèle (hors de pré-médicament et le médicament pour le post-infusion) ou un modèle spécifique en fonction des données. Nous avons utilisé le programme Stimuler 21 pour déterminer un modèle GLM basée sur les données. Effectuer une à deux échantillons T-test (par exemple dans Stimuler) sur tous les volumes de base comparativement à tous les volumes après la provocation. En option, laissez out le premier volume (s) et le volume au cours de laquelle le défi est donnée, depuis ceux ne peut pas représenter l'état d'équilibre d'imagerie. Par la suite, la discrimination tous les voxels avec plus d'un changement du niveau de référence% certain. Nous avons utilisé tous les voxels avec plus de 1% de variation. Ensuite, en moyenne au cours du temps dans tous ces voxels, qui vous donne déjà une idée de la forme du modèle. De cette manière, il peut être déterminé si le défi 1) a un effet immédiat ou différé, 2) si et quand l'effet atteint un plateau et / ou de pointe et, 3) si, ou quand l'effet diminue à nouveau au cours du temps de la numériser. Des exemples sont présentés dans la figure 4A et 4B. 6.2 La prochaine étape est donc de tester statistiquement l'image brute 4D séries chronologiques de chaque animal par rapport au modèle GLM établi précédente. Pour cela, nous avons utilisé le programme de FLS FEAT (IRMF outil d'analyse d'experts, v5.98) 17,24. Toutefois, d'autres outils d'analyse IRMf sont disponible aussi bien. Dans l'outil d'analyse, une analyse de premier niveau doit être mis en place. Cela nécessite les étapes suivantes: Assurez-vous d'utiliser les mêmes paramètres pour chaque animal. Vous pouvez choisir de supprimer les premiers (deux) avant l'analyse des volumes, depuis l'état d'équilibre d'imagerie peuvent ne pas être encore atteint à ce point. Réglez le TR, ce qui est le temps (en secondes) entre le début de chaque volume successives. Puisque vous êtes à la recherche à des effets qui pourraient durer toute la durée de balayage, il n'est pas nécessaire de définir un filtre passe-haut ou bas. Spatialement lisser les données afin de réduire le bruit et améliorer le rapport signal à bruit (SNR) ratio. Nous avons choisi un noyau FWHM de 8 mm. Maintenant, exécutez le modèle GLM désirée sur vos données. Ceci est votre principale variable explicative (EV), c'est à dire la forme d'onde que vous testez vos données contre. Le GLM qui était déterminé sur la base de nos propres données peut être vu dans la figure 4C. Il ya aussi la possibilité d'ajouter d'autres confondent EV, tels que les paramètres du mouvement,bruit à basse fréquence (dérive du scanner) ou même des paramètres physiologiques comme la pression artérielle pour enlever générales physiologiques des médicaments les effets. Dans FEAT: FILM utilisation prewhitening. Ajouter dérivée temporelle. Dans l'onglet Contrastes & F-tests, mis en place un contraste. Pour convertir un seul EV dans une image statistique Z, définissez sa valeur de contraste à 1. Cela vous donne tous les voxels dans lequel son évolution dans le temps peut être expliquée de façon significative par le GLM. Réglage de la valeur à -1 donnera l'activation négative. Après avoir effectué le test statistique initial, l'image résultante statistique doit être seuillée pour montrer ce qui voxels ou des groupes de voxels sont activés à un niveau de signification particulière. Multiple de correction des comparaisons est nécessaire en raison du grand nombre de voxels du cerveau testés. Le programme de FLS FEAT utilise un système automatisé fondé sur les grappes de correction des comparaisons multiples basé sur le GRF (gaussienne champ aléatoire) la théorie 25. Enfin, les données doivent être spatialement normalisé à une image de référence, afin d'effectuer des statistiques de groupe. Premier registre les données fonctionnelles aux animaux cerveau-extrait d'image anatomique et ensuite à l'image de référence. Nous avons utilisé le modèle de rat stéréotaxique du cerveau décrite par Schwarz 14 comme un cerveau de référence. Après cela, les analyses de premier niveau de tous les animaux peuvent être combinés dans échelons supérieurs (groupe) des analyses statistiques. Cela est très dépendante de la conception de votre propre étude et les questions de recherche. 6.3 Après cela, les analyses de premier niveau de tous les animaux peuvent être combinés dans échelons supérieurs (groupe) des analyses statistiques. Cela est très dépendante de la conception de votre propre étude et les questions de recherche. 6.4 Réponses physiologiques de médicaments peut être couplé ou lié au signal MR, si on le souhaite. Voir aussi la section 6.2.3 sur l'ajout de confondre EV. 7. Les résultats représentatifs ove_content "> Lorsque le médicament stimulant (5 mg / kg iv fluoxétine) pénètre dans le système vasculaire, une réponse claire physiologique doit être visible dans le taux de respiration (en haut) et la pression artérielle (en bas). Ces réponses normaliser en moyenne dans les 5-10 min . Dans la figure 3 de cette baisse de la pression artérielle est clairement visible. Le cours moyen du signal de temps devrait montrer un niveau de référence relativement stable et un effet évident de relever le défi. De préférence, il devrait y avoir aucune dérive défi-indépendante dans le signal. Un exemple représentatif d'une évolution dans le temps moyen du signal peut être vu dans la figure 5A. Les artefacts, tels que la dépression respiratoire / échec ou des modifications en matière d'anesthésie sont souvent clairement visibles dans le signal. La dépression respiratoire affectera négativement le signal dans le cerveau tout entier. Cela peut être vu sur la figure 5B. Après analyse de premier niveau, le modèle d'activation devrait être essentiellement positive et de localisationTed dans des régions spécifiques seulement (c.-à-aires corticales, l'hippocampe, l'hypothalamus et le thalamus; voir la figure 6A). Si l'ensemble du cerveau est désactivé, ce qui est souvent une indication de l'anesthésie trop profonde et / ou manque d'oxygène lors de la numérisation. Un exemple de ceci peut être vu dans la figure 6B. Figure 1. Lieu du stage des canules dans l'artère et la veine fémorales. Figure 2 Représentation schématique de l'installation IRM;. Tout le matériel doit être non-ferromagnétique et est relié à un système de module qui permet l'acquisition d'images gated éviter les interférences de mouvement dû à la respiration et / ou battement de coeur. La température du corps est également régie par un module de chauffage pour surveiller et contrôler la température des animaux lors de l'imagerie. Cliquez ici pour agrandir l'image . Figure 3. Exemple représentatif des données de pression artérielle. Il ya une nette diminution de la pression artérielle visible directement après le début de la perfusion (barre rouge). Les valeurs normales sont de nouveau atteint moins de 10 min. après l'administration défi. Figure 4. Un modèle) d'activation prévue en utilisant le programme d'analyse IRM Stimuler (le rouge est d'activation positive, le bleu est l'activation négative). B) Bien sûr le temps moyen de tous les voxels activés (changement ≥ 1% par rapport au départ) chez tous les animaux. C) Exemple du modèle GLM résultant en FLS / FEAT. Cleuillez ici pour voir plus grand chiffre. Figure 5. Exemple d'activation positive. Au cours du temps dans les voxels activés (rouge) est la suite à peu près la forme du modèle GLM. Infusion de la drogue a commencé autour de 8 points de temps. Exemple d'activation négative dans le cerveau entier après une anesthésie trop profonde. Le cours du temps dans les voxels activés négativement (bleu) montrent un déclin général dans le signal et aucun effet de ce défi est visible. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 6. Prévue pattern d'activation après une analyse de premier niveau. L'activation de groupes de voxels (rouge pour yjaune), seulement dans des zones spécifiques du cerveau. Exemple de modèle d'activation de «mauvais». L'activation du cerveau entier négatif (bleu) dans le même animal que dans la figure 5B.