Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em> In vivo</em
Summary
Floresan boya retrograd taşıma anatomik projeksiyona dayalı nöronların bir alt-nüfus etiketler. Etiketli akson görsel olarak hedeflenebilir<em> In vivo</em>, Belirlenen aksonlardan ekstraselüler bir kayıt izin verir. Bu teknik nöronlar genetik manipülasyon yoluyla etiketli ya da izole etmek zor olamaz zaman 'kör' kullanarak kayıt kolaylaştırır<em> In vivo</em> Yaklaşımlar.
Abstract
Bu yöntemin genel amacı nöronların tanımlanmış bir nüfus tek ünite, kaydetmektir. Bireysel nöronlar in vivo elektrofizyolojik olarak nöral devrelerin doğal şartlar altında nasıl çalıştığını anlamak için önemlidir. Geleneksel olarak, bu kayıtları kaydedilen hücrenin kimliğini kaydın başlangıcında bilinmemektedir yani, 'kör' yapılmıştır. Hücresel kimlik ardından hücre içi juxtacellular 1, 2 ya da gevşek yama boya 3 iyontoforez vasıtasıyla tespit edilebilir, ancak bu kayıtlar fonksiyonel farklılıklar hücre tipleri ile bölgelerindeki özel nöron için önceden hedeflenen edilemez. Floresan proteinleri görsel güdümlü tek hücreli elektrofizyoloji 4-6 izin veren bir hücre tipi özel bir şekilde ifade edilebilir. Ancak, bu genetik araçlar mevcut değildir kendisi için birçok model sistemler vardır. Hatta genetik kolay kullanılabilir sistemlerde, istenen promoter bilinmeyen olabilir veya genetik olarak homojen nöronların projeksiyon modelleri farklı olabilir. Benzer şekilde, viral vektörler projeksiyon nöronlarının 7 belirli alt etiketlemek için kullanılmaktadır, ancak bu yöntem kullanımı trans-sinaptik özgüllük toksisite ve yokluğu yüzünden kısıtlıdır. Böylece, in vivo olarak tanımlanan tek nöronlardan kaydetmek için özel ön-görselleştirme sunan ek teknikler ihtiyaç vardır. Hedef nöron Ön görüntüleme klasik tek hücre kayıtları genellikle 8-11 engelleyici zor olan kayıt için zorlayıcı koşulları için özellikle yararlıdır. Bu yazıda anlatılan roman tekniği böylece hedef elektrofizyolojik elde etmek için görsel bir ipucu sağlayan, hızlı ve seçici kendilerine özgü aksonal projeksiyonlar göre belirli bir beyin bölgesi içindeki hücrelerin belirli bir alt etiket tungsten iğne kullanarak bir floresan boya retrograd taşıma uygulandı kullanır sağlam bir devre withi tespit nöronlardanna MSS omurgalı.
Bizim yöntemin en önemli yeni bir gelişme, bir sigara genetik olarak erişilebilir bir model sistemde özel hücre tipleri hedef floresan etiketleme kullanılmasıdır. Zayıf elektrik balık hayvanlar 12 davranıyor, uyanık nöral devreleri eğitim için mükemmel bir model sistem bulunmaktadır. Biz zayıf elektrik mormyrid balık ön exterolateral çekirdeğinde "küçük hücreler" (ELa) tarafından duyusal işleme incelemek için bu teknik kullanılmaktadır. "Küçük hücreler" presinaptik sivri 13 gelişi zamanlarda submillisecond farklılıkları tespit etmek için önemli bir zaman karşılaştırma nöronlar olduğu öne sürülmüştür. Ancak, bu tür yoğun miyelin, içine çeken sinaps ve küçük hücre gövdeleri gibi anatomik özellikleri son derece zor geleneksel yöntemlerle 11, 14 kullanılarak bu hücrelerden kayıt yaptık. Burada güvenilir, sağlam kayıtları ve karakteristiklerini sağlayan, bizim yeni bir yöntem seçerek hazırlıkları 28% bu hücrelerin etiketler göstermektedirelectrosensory uyarıya yanıtların zasyon.
Protocol
Discussion
Bir kere hakim, bu teknik bir çok model sistemler in vivo kayıtlarında için ayrı akson dahil olmak üzere tespit nöronlar, hedef sağlayacaktır. Buna ek olarak, bu teknik bir güvenilir zorlu in vivo kayıt yöntemleri geleneksel sağlayan benzersiz anatomik özelliklere sahip nöronlardan başak çıkış kaydetmenize olanak verir. Biz mormyrid zayıf elektrik balık ELa "küçük hücreler" den kaydetmek için bu tekniği kullanmış olurlar. "Küçük hücreler" ayar özelliklerini incelemek için önceki girişimler zorlu kayıt koşullarına 11, 14 nedeniyle başarısız oldu. Benzer anatomik özellikleri çok farklı omurgalı işitsel ve electrosensory nöronlar 8-10 tek birim kayıtları elde etmek için engeller oluşturmak. Sistemimizde bu zorlukları aşmak için, "küçük hücreler" bu ELa tek hücrelerin olduğu gerçeğini yararlandı ELP proje. Böylece, ELP yerleştirilir boya retrograd taşıma "küçük ELa Etiketleme sınırlarhücre "somas ve akson. akson Floresan etiketleme erişilemez somas rağmen mümkün tespit hücrelerinden tek birim kayıtları yapma, etiketli aksonlar yanında hassas elektrot yerleştirme izin verdi. Biz çevredeki yutma sinaps 11 nedeniyle muhtemelen, somatik kayıtları çalıştı, ancak başarısız oldu , 17. Bununla birlikte, açıkça bu somatik etiketleme tekniği diğer hücre türleri ve diğer devreler somatik kayıtları hedeflemek için kullanılabilir düşündüren görünür hale geldi. in vivo olarak geriye doğru aktarıma yoluyla nöronların fluoresan etiketleme in vitro 19-21 hedeflenen kayıtları ilerletilmesi için kullanılmaktadır . Benzer bir teknik zebrabalıkları omurilik 22 motor nöronların in vivo kayıtları hedeflenen için kullanılmıştır. Çalışmalarımız, etiketleme ve kayıt hem de beyinde in vivo yapılmaktadır ki, bu yaklaşım için yeni bir genişleme gösterir. Bizim yöntemi gösteren in vivo bir retrograd t MSS alanların etiketlemeyarışçı benzer seçici projeksiyon nöronları ile diğer sağlam devrelerin çalışma genişletilebilir. Örneğin, memeli işitsel işleme, alt kollikulus (IC) birden fazla rhombencephalic yapılar 23 girişleri için önemli bir aktarma merkezi olarak hizmet vermektedir. IC içine enjeksiyondan seçici bu çekirdeklerin her birinden projeksiyon hücreleri etiketlemek olacaktır. Üstün colliculus (SC) vizyon 24 için benzer bir işlev görür. Omurilik preparatlar özellikle omurilik kolayca erişilebilir olduğu gibi, boya püskürtme kadar kayıt sitesinden oluşabilir, bu yöntem için uygun olan, ve daha detaylı bilgiler anatomik 25 elde etmek için seçme nöronların hücre içi kayıt ve doldurma ile kombine edilebilir. Son olarak, sistem-izleme karmaşık devre 26 eşleştirmek için merkezi sinir sistemi boyunca kullanılan iyi kurulmuş bir tekniktir. Bizim yöntemi w yapılmıştır bu çalışmalara işlevsel bilgi eklemek için kullanılabilirkedi görsel korteks 27. ith kalsiyum duyarlı göstergeler.
Iyi kurulmuş olan cerrahi, güvenilir ve düzenli in vivo kayıtları 16 kör için kullanılan, minimal kanama ve hayvan ve hayatta kalmak için doku sağlamak için beynin yüzeyine zarar ile tamamlanması gerekir. Uygulama ile, cerrahi ve boya uygulama 30-45 dakika içinde tamamlanabilir. Biz başarıyla hazırlıkları% 67 in "küçük hücreli" akson etiketli. En hazırlıkları sadece 1 veya 2 görünür etiketli aksonlar var, ancak bazı olarak 8 var. Teşebbüs 119 etiketli birimlerinin, biz 12 preparatları (Tablo 2) üzerinden dağıtılan 26 birimlerden tek birim kayıtları elde. Böylece, veri% 28 genel başarı oranı için etiketli akson ile hazırlıkları 41% toplanmıştır.
Boya uygulamasının kritik yönü derinliği etiketleme. Tungsten telinin Sığ ekleme yıkanmış w olan boya ile sonuçlanacaktıray. Penetrasyon çok derin ise, ancak, etiketli akson hedef görebilir olmayacaktır. Bundan başka, hücre için bazı mekanik hasar yeterince 25, 28 ele alınması boya için gerçekleşmelidir. Ancak, çok fazla zarar hücreleri öldürür. Biz ELP etiketlenmesine akson (Tablo 3) kayıt ile eşleştirilmiş ELa içine boya enjeksiyon yoluyla anterograd etiketleme dahil olmak üzere diğer boyalar ve diğer yöntemlerle (Tablo 2), ile etiketleme çalıştı. Biz etiketleme onlara tepkisiz hale somatik hasar hücrelerin sınırlı olduğu için ileriye etiketleme başarılı olmadığını hipotez. Buna ek olarak, pre-sinaptik terminalleri rahatsız olabilir. Buna karşılık, retrograd etiketleme bu endişeleri her iki en aza indirir. Miktarı ve boya uygulama yer çalışılmaktadır belli bir devre uygun olarak modifiye edilebilir. Maksimal etiketleme biz kaplanmış tungsten tellerin kullanılarak elde büyük boya konsantrasyonu oluşur. Ancak de olan aksonlar Etiketlemebu gelişmiş olduğu gibi ep projeksiyonlar, boya bir tungsten iğne yerinden çıkabilir. Bu durumda, basınçlı enjeksiyon daha uygun olacaktır. Boya alımı ve ulaşım 2 saat sonrası enjeksiyon ve 6 saat sonrası enjeksiyon gibi geç görünen ek etiketli akson gibi erken görünür olmak bizim hazırlık etiketli akson ile, hızlıdır. Böylece, etiketleme ve kayıt hayatta kalma cerrahi ile ilgili teknik sorunlar ortadan kaldırarak, tek bir gün içinde yapılabilir. Zamanlama boya nakil için gerekli olan mesafeye bağlı olarak, her uygulama için değişecektir.
Diğer önemli yönü elektrot yerleştirilmesidir. Bu ucu tıkanmasını önlemek için etiketli akson siteye doku yakın girmek için önemlidir. Bu ELa gibi yoğun doku için, kayıt elektrot üzerinde uzun, ince bir sap çevre dokulara aşırı hareketi en aza indirir. Başarılı bir kayıt bir kayıt elde edilene kadar taze elektrotlar ile ilk denemede, tekrar üzerinde elde veya tiss değilseue akson artık görünür hangi noktaya bozulur. Bununla birlikte, hızlı bir şekilde ağartma fototoksisite neden maruz floresan, miktarını en aza indirmek için ve hücre 29-31 fizyolojik özelliklerini etkileyebilir akson yanındaki elektrot yerleştirmek için de önemlidir.
Akson bir bölümünü başarıyla kayıt elektrot içine emilmekte sonra, kayıtlar birkaç saat boyunca elde edilebilir. Birimleri sürekli az 1 saat içinde kaybolur üzerinden kaymasını akson önlemek için küçük elektrot uçları yapmayı düşünün. Öte yandan, bir ucu çok küçük akson için tıkanma, düşük sinyal-gürültü, ya da hasara neden olabilir. Başak genlik ve ek emme ile bir birimin 'dönüş' bir sürekli azalma ucu çok büyük bir göstergesidir. Çok fazla emme akson onarılamaz hasara neden olabilir. Bir çözüm, basınç yavaş yavaş sıfıra döner böylece hava hattı küçük bir sızıntı sağlamaktır. Hızla inci dengelemee basınç akson sınırdışı edebilir geçici bir akraba-dışa 'itme' verilecektir.
Bu teknik belirlenen projeksiyon nöronlardan hedeflenen kayıtları elde etmek için büyük bir avantaj sağlamasına rağmen boya enjeksiyon sitesinde tüm hücre tipleri tarafından alınması gibi, bu, yerel internöronlar ayırt için yararlı olmayacaktır. Teorik olarak, ayrı enjeksiyon siteleri ile birden fazla fluorophores kullanımı bu yöntem genişletilebilir izin verebilir. Örneğin, tek-veya çift-etiketleme karşılaştırma devresi 32, iki nokta, çift enjeksiyonları ardından projeksiyon nöronlarının ikinci internöron ayırt etmek için kullanılabilir. Benzer şekilde, retrograd izleyiciler zebra ispinoz Yüksek Vokal merkezi (HCV) 32 son zamanlarda yapıldı gibi iki foton görüntüleme gibi diğer gelişmiş görüntüleme teknikleri,, ile kombine edilebilir. Epifloresans mikroskop kullanırken Ayrıca, kayıt bölgeleri biz sadece ve 1 çözmek mümkün olduğu gibi, yüzeye yakın olanlar ile sınırlıdırmu, doku ilk 30 mikron içinde m yapılar. Ancak, bu derinliği gibi iki foton mikroskopi 33 veya objektif-birleştiğinde düzlemsel aydınlatma mikroskobu 34 gibi diğer mikroskopi teknikleri kullanımı yoluyla genişletilebilir. Nispeten erişilebilir olduğunu da dahil olmak üzere – bu model sistemler çeşitli birçok farklı devrelerinde tek nöronlardan kaydetmek için kullanılabilir, çünkü genel olarak, bu teknik, in vivo olarak nöral devrelerin çalışma önemli bir gelişmeyi temsil etmektedir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TK G2205 (Bilim Teşvik Ulusal Bilim Vakfı (BAC için IOS-1.050.701), Ulusal Sağlık Enstitüleri (SM için NS54174 ve AML-W F30DC0111907.), Uehara Memorial Foundation ve Japon Derneği tarafından sağlanan finansman .) Biz hücre dışı aksonal kayıtların konuda verdiği destek ve rehberlik için Julian Meeks teşekkür ederim. Biz bir prototip kayıt odasına sağlamak için Carl Hopkins teşekkür ederim.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Tricaine Methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Gallamine Triethiodide | Sigma-Aldrich | G8134 | Flaxedil |
| Lidocaine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | |
| Hickman’s Ringer Solution | NA | NA | NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l) |
| Peristaltic Pump | Gilson or Rainin | Minipulse 3 Model 312; RP-1 | 10.0 ± 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter |
| Dissection Microscope | Nikon | SM2645 | |
| Super Glue | Super Glue Corporation | SGH2 | 2g tube |
| Omni Drill 35 | World Precision Instruments | 503-598 | |
| Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | 0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm) |
| Low Temp Cautery Kit | World Precision Instruments | 500391 | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Dextran Conjugated Alexa Fluor 568 | Invitrogen | D-22912 | 2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings |
| Epifluorescent Microscope | Nikon | E600 FN | A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter – or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths |
| Low Power Objective | Nikon | 93182 | CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm |
| High Power Objective | Nikon | 93148 | CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm |
| White Light Source | Dolan-Jenner | Model 190 | Fiber Optic Illuminator |
| Fluorescent Light Source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | |
| Low-light Level Camera | Photometrics | CoolSnap ES | |
| Digital Manometer | Omega Engineering | HHP-201 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV-7B | Axon Instruments |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | Axon Instruments |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Axon Instruments |
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: ‘0’, Velocity: 60, Time: 90 Box filament |
| Pipette Glass | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID) |
References
- Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus. J. Physiol. 566, 425-441 (2005).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo–a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).
- Margrie, T. W. Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo. Neuron. 39, 911-918 (2003).
- Lima, S. Q., Hromádka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, e6099 (2009).
- Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons. J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).
- Lehman, M. N. Herpes simplex virus as a transneuronal tracer. Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).
- Joris, P. X. A dogged pursuit of coincidence. J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).
- Heiligenberg, W., Rose, G. Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia. J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).
- Morales, E. Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS. Pflügers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).
- Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish. J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).
- Hitschfeld, &. #. 2. 0. 1. ;. M., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish. ILAR. J. 50, 361-372 (2009).
- Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish. J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).
- Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior. J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).
- Carlson, B. A. Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior. J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).
- Mugnaini, E., Maler, L. Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis. Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).
- Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection. J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).
- Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system. Brain Res. 486, 334-339 (1989).
- Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex. Nature. 310, 498-500 (1984).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457, 1133-1136 (2009).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
- Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. Dissecting the circuitry of the auditory system. Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).
- Wurtz, R. H., Albano, J. E. Visual-motor function of the primate superior colliculus. Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).
- O’Malley, D. M., Zhou, Q., Gahtan, E. Probing neural circuits in the zebrafish: a suite of optical techniques. Methods. 30, 49-63 (2003).
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
- Gahtan, E., O’Malley, D. M. Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish. J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).
- Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice. J. Physiol. 550, 159-167 (2003).
- Mennerick, S. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).
- Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons. J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).
- Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning. Nature. 463, 948-952 (2010).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
