Retrograde Fluorescerende Labeling Maakt Gerichte Extracellulair Single-unit Opnemen van geïdentificeerde neuronen<em> In vivo</em

1. Bereid Dye-gecoate Naalden Elektrolytisch scherpen een 160 micrometer diameter wolfraam draad 15. Final naald diameters moeten variëren 5-50 micrometer. Het aantal naalden nodig is hangt af van de grootte van het gebied is gemerkt. We bereidden 5 naalden voor 3-5 injecties in de achterste exterolateral nucleus (ELP). De avond voor het experiment, een druppel (<0.25 pl) van 2 mM dextran-geconjugeerde Alexa Fluor 10.000 MW verf op de distale 100 um van elke naald. Laat de naalden aan de lucht drogen bij kamertemperatuur, waardoor geconcentreerde kleurstof aan het uiteinde. Bewaar de naalden bij 4 C in een donkere container ter bescherming tegen licht °. 2. Bereid Animal voor Heelkunde Induceren algemene anesthesie door het plaatsen van de vis in een oplossing van 300 mg / L MS-222 in water tank. Weeg de vis en de maatregel vorklengte (tip van snuit tot splitsing van de staartvin) en body diepte (maximale dorso-Ventral afstand in het dwarsvlak). Deze metingen moeten binnen de in tabel 1, zodat de vis past in een opname kamer klein genoeg voor onder een water-immersie microscoop objectief (figuur 1) in het bereik vallen. Immobiliseren en elektrisch geluid van de vis door het injecteren van 100 ul van 3 mg / ml flaxedil in het dorsale lichaam spiermassa. Vul de opname kamer (Figuur 1A) met tank water. Leg de vis ventrale zijde naar beneden op het platform in het midden van de kamer (figuur 1). Lever een beluchte oplossing van 100 mg / L MS-222 met behulp van een pipet in de mond van de vis (1-2 ml / min). Het stabiliseren van de vis met in was geplaatst aan beide zijden van het lichaam (figuur 1C) vast staven. De conditie van de vis door te controleren op continue bloedstroming in het oculaire vaten en een normale lichaamskleur. Draai het platform langs de lange as en laat de back-end van de platform zodat een zijde van het dorsale oppervlak van de kop van de vis wordt blootgesteld boven het water terwijl de rest van het lichaam van de vis ondergedompeld blijft. Een klein stukje van Kimwipe moet op elke niet-ondergedompelde deel van de huid uitdrogen te voorkomen worden geplaatst. 3. Surgery (figuur 2) De basis chirurgische procedure beschreven is goed ingeburgerd en betrouwbaar voor blinden in vivo opnames mormyrids 16. Voor andere toepassingen, bloot de gewenste regio's voor de etikettering en opnemen. Het gebied dat axon terminals van de cellen van belang moet zijn bereikbaar via een kleurstof beklede naald. Het gebied dat meer proximale segmenten van dezelfde axons voldoende ruimte boven het weefsel moeten de werkafstand van het water-immersie objectief (2 mm in ons geval) tegemoet. Breng een 0,4%-oplossing van lidocaïne op het blootgestelde oppervlak van het hoofd met behulp van een Q-tip. Met behulp van een scalpel, snijd de omtrek van een rechthoekig stukje huid. Verwijder de rechthoek met een paar pincetten. De grootte van de rechthoek schaal met vis maat, maar moet ongeveer 3 mm x 5 mm voor 6,2 cm vis (Figuur 2A). De laterale rand van de rechthoek overeenkomt met die midden van het oog, zou de voorste rand van de rechthoek juist achter het oog, en de mediale rand van de rechthoek moet net lateraal van middellijn van de vis zijn. Vouw de blootgestelde schedel regio anteromedially om een extra 2,5 mm vierkant niet-overlappende gebied (Figuur 2B) bloot te leggen. Helemaal leeg te maken en droog het blootgestelde oppervlak van de schedel met de scalpel om weg te schrapen overtollige weefsel en Kimwipes en gedwongen de lucht aan het oppervlak (figuur 2C) drogen. Lijm een ​​metalen paal op de anteromediale blootgestelde schedel regio met superlijm. Wacht tot de lijm volledig droog is (figuur 2D). </li> Verwijderen van een rechthoek van de schedel, ongeveer 2 mm X 4 mm voor een 6,2 cm vis. Gebruik een tandheelkundige boor met een ~ 0.5 mm diameter kogelmolen carbide tip om de omtrek van de rechthoek te verdunnen. Vervolgens, met behulp van een scalpel en pincet, snijd de omtrek van de rechthoek en schil het weg aan de onderliggende hersenen bloot te leggen. Extra boren of snijden met een klein schaartje kan nodig zijn om EL (figuur 2E) volledig bloot. Als spierbloeding optreedt, kan een elektrocauterisatie apparaat worden gebruikt. Weggesneden zowel de dura mater (gepigmenteerd) en de pia mater (duidelijke) met behulp van de lente schaar of naald en verwijder de plankjes met een pincet. De voorste en achterste delen van het exterolateral nucleus (EL) zijn nu zichtbaar, ELA en ELP, respectievelijk (figuur 3A). 4. Retrograde Labeling van axonen van Interest Plaats een manipulator met kleurstof beklede naald (in stap 1) werd het doelgebied die axons van interest, in ons geval elp. Vlug steek de naald ongeveer 25 micrometer in het weefsel. Wacht 15-30 seconden, totdat alle kleurstof is eraf, en dan trekken de naald. Herhaal met extra verse naalden nodig plaatsen elk op een andere locatie zodat de kleurstof verspreid het doelgebied. We gebruikten 3-5 naalden per preparaat. Spoel overtollige kleurstof uit de holte met Hickman's beltoon oplossing. Wacht minstens 2 uur kleurstofopname en transport. 5. Visualisatie van Axonen van Interest Plaats de opname kamer, samen met de vis, onder het doel van een verticale, vaste-fase epifluorescerende microscoop. Als het lichaam van de vis afsluit lichtinval, moeten zowel wit en fluorescerende lichtbronnen van boven komen. Zorgvuldige plaatsing van een glasvezel lichtbron boven de schedel holte laat bevredigend brightfield afbeeldingen. Voor epifluorescentie bekijken, fluorescentie filterspecificaties moeten overeenkomen met de absorptie / emissie-spectrum van de kleurstof. Overschakelen ademhaling om verse tank water en behouden hetzelfde debiet. Plaats een aardedraad in de blootgestelde hersenen holte en maak verbinding met de grond van de opname headstage (zie 6.3). Plaats een paar registrerende elektroden naast de basis van de staart en verbinden met een differentiële versterker en meters (bijv. audio monitor oscilloscoop of computer) om de elektrische ontlading orgel commando (EODC) volgen. Nadat de vis herstelt van anesthesie kan EODC worden gebruikt als een indicator van de toestand van de vis. Bereid een geschaalde schets van het gebied hersenen bekeken bij een lage vergroting. Behoren grote bloedvaten als oriëntatiepunten (kan variëren van vis tot vis) om de exacte locatie van het label axonen alleen zichtbaar onder hoge vergroting (figuur 3D) te identificeren. Bevestigen kleurstof plaatsing. Bekijk eerst gehele weefsel met helderveld verlichting voor oriëntatie ( <strong> Figuur 3A). Vervolgens bekijken met fluorescerende verlichting (Figuur 3B). Elp zal hebben diffuse etikettering (Figuren 3B en 3C). Minimaliseren fluorescentie excitatie aan de fotodynamische en fototoxische effecten van de kleurstof te beperken. Gebruik de schepen als oriëntatiepunten voor ELA onder hoge vergroting lokaliseren. Verlichten met tl-licht tijdens het zoeken naar een label axon nabij het oppervlak. (Figuur 4). 6. Opnemen Extracellulair Activiteit Trek zuigkracht registrerende elektroden met 1 mm OD, 0,58 mm ID borosilicaatglas capillaire glas voor gloeilampen. Ideaal tip grootte zal afhangen van de diameter van het doel axonen, die in ons geval is 0,1-0,2 urn 17. Voor onze toepassing, elektrode tip diameters waren 1,5 ± 0,4 micrometer (range: 1,0-2,4 micrometer) met een 5 mm lange, smalle schacht om de gelabelde axonen benaderen zonder het verplaatsen van het omringende weefsel te dicht op elkaar gepakt. Vul electroden met gefilterd Hickman's beltoon oplossing. Laatste tip weerstand is 45,2 ± 38,0 MQ (bereik: 16-155 MQ). Plaats de elektrode in een elektrode houder met een druk-poort en sluit deze aan op een versterker headstage gemonteerd op een manipulator. Voer een drukleiding van de drukpoort een T-splitsing eindigend in een manometer en een injectiespuit voor het bewaken en regelen van de druk, respectievelijk. Sluit de headstage een versterker en een analoog-digitaal acquisitieapparaat. Met 30 mbar buitenwaartse druk op de elektrode lijn, plaatst een elektrode naast een label axon. Een low-light level camera gekoppeld aan imaging software wordt gebruikt om de pipet plaatsing visualiseren. Beginnen bij het weefsel oppervlak en vooraf de elektrode naar het axon. Als je het axon naderen, moet de buitenwaartse druk een lichte, maar merkbare beweging van het axon veroorzaken. Terwijl de elektrode is naast het axon, (figuur 4A, boven) nemen de potenteial aan de elektrode tijdens de presentatie van teststimuli (in ons geval, gebruikten we 100 msec monofasische positieve en negatieve transversale pulsen met een intensiteit van 20 mV / cm; Figuur 1A). Actiepotentialen niet worden nageleefd, maar een elektrische artefact bevestigt goede opname / stimulatie (Figuur 4A, onder). Laat de buitenwaartse druk op de elektrode en herhaal stimulatie / registratie. Actiepotentialen mag nog niet worden waargenomen (Figuur 4B). Oefen lichte (125 ± 25 mbar) zuig aan de elektrode en herhaal stimulatie / registratie. Actiepotentialen moet nu worden waargenomen in respons op stimulatie (Figuur 4C). Spontane activiteit kunnen ook optreden. Als actiepotentialen niet worden nageleefd, laat de zuigkracht, duidelijk de elektrode met lichte druk, opnieuw lichtjes te bewegen de elektrode, en poging zuigkracht. Zodra actiepotentialen zichtbaar zijn, sluit de drukleiding. Stimuleren en op te nemen alsgewenst. 7. Beëindiging en verwijdering Wanneer alle opnames zijn voltooid, schakelt de ademhaling met 100 mg / L MS-222 tot EODC gestopt. Geen EODC moeten gedetecteerd minstens 10 minuten. Gooi de vis volgens de institutionele richtlijnen en erkende zorg protocollen dier. 8. Representatieve resultaten Voor onze specifieke toepassing, wij zijn geïnteresseerd in het bestuderen van stimulus codering door centrale sensorische neuronen. Succesvolle opname van gelabelde axonen analyse toelaten van een enkele eenheid reacties op sensorische stimulatie 18. Figuur 5A toont representatieve actiepotentialen opgewekt door dwarse electrosensory stimulatie met bipolaire elektroden die zich aan de binnenkant van de linker en rechter wanden van de opname kamer. Spike tijden kan worden gepresenteerd als een piek raster plot (Figuur 5B). Een 25 msec pre-stimulus opname window toont het lage niveau van spontane activiteit. Deze bijzondere ELA "small cell" lang-pass afgestemd stimulusduur op een stimulus intensiteit van 6 mV / cm, waardoor het aantal takken per herhaling en stimulusduur toeneemt (figuur 5C). De gemiddelde eerste piek latency is 4,28 ± 0,16 msec, in overeenstemming met de verwachte wachttijd voor kleine cellen in ELA 11. Figuur 1. Specificaties voor een opname kamer die past onder de doelstelling van een vaste-fase epiflourescent microscoop. (A) To-schaal vierkante opname kamer gemaakt van plexiglas die uitzichten top, zij-en achterkant. Gepaarde sets van stimulatie-elektroden (sterretjes) bij de omtrek zorgen voor zowel transversale (rood-zwart) of longitudinaal (blauw-geel) stimulatie. Een extra stuk van plexiglas in de hoek, met een rubber beklede gat in het midden (oranje),houdt een zuig pipet die een constant waterpeil handhaaft. Twee verticale roestvrijstalen berichten geschroefd in de bodem van de kamer (constant groen) verbinding roestvaststalen posten (groene overzicht) aan het platform waarop de vis (lichtgrijs, beschreven in C) via verstelschaal klemmen. Een foto van de kamer wordt getoond onder het op schaal tekenen. (B) Individuele en geassembleerd uitzicht op de cirkelvormige plastic schijf klemmen gebruikt om het platform naar de verticale stijlen te beveiligen. Elke schijf klem heeft een groef (groen) voor een post en een gat in het midden van de spanschroef. Disc klemmen gedraaid zodat de groeven loodrecht op elkaar. Aandraaien van de schroef (rood) klemmen van de berichten op zijn plaats om verdere verticale en roterende beweging van het platform te voorkomen. (C) Voor-en zijkant op schaal uitzicht op het plexiglas platform gebruikt om de vis op zijn plaats te houden. Het platform is bedekt met een laag van paraffine (blauw) die houten dowe houdtls (zwarte balken) op zijn plaats om de vis te ondersteunen. Buizenstelsel voor beademingsinrichting de vis door een gat in de 'hoofdeinde' van het platform en eindigt in een pipetpunt in de mond van de vis. Een roestvrij stalen kop bericht (grijze balk) wordt aangesloten op het platform via een kogelgewricht waardoor 360 graden rotatie. RVS horizontale berichten (groen) worden geschroefd in een van beide eind van het perron. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Figuur 2. Schematisch overzicht van de operatie kijken neer op het dorsale oppervlak van de kop. (A) Maak vier bezuinigingen, in de aangegeven volgorde, om een rechthoekig stukje huid (rood) te verwijderen. (B) Trek de opening anteromedially om een extra rechthoekig stuk te verwijderen van de huid (groen). (C) Schraap alle resterende vet of ligamenten doorhet verplaatsen van de scalpel, zoals aangegeven door de pijl en droog het oppervlak volledig met Kimwipes en gedwongen lucht. (D) Lijm een roestvrijstalen paal aan de schedel met superlijm. Schaal bar in A geldt voor AD. (E) Gebruik een tandartsboor tot vier sneden maken, in de aangegeven volgorde, om een rechthoekig stuk bot (blauw) te verwijderen, waardoor de voorste en achterste exterolateral kernen (ELA en ELP, respectievelijk) . Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Figuur 3. Fluorescentielabelling in de achterste exterolateral kern 3 uur na injectie van dextran-geconjugeerde Alexa Fluor 568. (A) de voorste en achterste exterolateral kernen (ElA en ELP respectievelijk) gevisualiseerd met helderveld van bovenaf. Notadat de uitgebreide myelination binnen Ela geeft het een relatief heldere uitstraling die het onderscheidt van Elp. (B) Dezelfde regio gevisualiseerd met behulp van epifluorescentie bekeken via een TRITC filter. (C) A samengevoegde afbeelding met blauw voor A (helderveld) en rood voor B (TRITC). (D) Voorbeeld van een verkleinde tekening van ELA en ELP waaronder grote bloedvaten (rode lijnen) die kunnen worden gebruikt als oriëntatiepunten voor de exacte locatie van het label axonen alleen zichtbaar onder hoge vergroting (de exacte locatie van de bloedvaten te identificeren varieert van vis tot vis). Gestippelde lijn geeft de grens tussen ELA en Elp. (E) Monster beelden verkregen met behulp van een TRITC filter uit 5 verschillende preparaten ter illustratie van een reeks succesvolle etikettering patronen van kleine cel axonen en SOMA in ELA. Figuur 4. Single-unit extracellulairevan een label axon. (A) Opname elektrode (pijlpunt) onder positieve druk geplaatst grenzend aan een gelabelde kleincellige axon in ELA (top) registreert alleen edge artefact (pijlpunten) in reactie op een 100 msec 20 mV / cm monofasisch, contralaterale-positieve, dwars vierkante puls (onder). (B) loslaten buitenwaartse druk van de elektrode (pijlpunt) veroorzaakt de axon iets richting van de elektrode (geplaatst), maar er is nog geen reactie op de stimulus (bodem). ( C) Lichte onderdruk trekt het axon naar de elektrode (top, pijlpunt) en actiepotentialen in reactie op stimulusaanvang zijn nu zichtbaar (bodem, sterretje). Onderste helft van alle drie panelen bedekt reacties op 20 herhalingen van de stimulus. Figuur 5. Representatieve resultaten met deze techniek. (A) 5 monster sporentoont actiepotentialen opgewekt door een 0,1 msec 6 mV / cm monofasisch, contralaterale-positieve, dwarse vierkante puls stimulus. (B) Raster perceel tonen spike keer tijdens 20 herhalingen van een 75 msec raam opname voor dezelfde eenheid gestimuleerd op tijdstip 0 met 6 mV / cm stimuli bij de selectie van beursgenoteerde rechts duur. (C) Duur stemmingscurve kwantificeren van de reacties weergegeven in het raster als spikes per stimulus herhaling. (G) Vork Lengte (cm) Body Diepte (cm) Betekenen 2.42 6.20 1.14 Standaarddeviatie 0.64 0.52 0.18 Reeks 1,2-4,0 5,5-8,4 0,9-1,6 Tabel 1. Optimalegewicht, lengte en body diepte varieert voor vissen. Optimaal gewicht, vorklengte (tip van snuit tot splitsing van de staartvin) en body diepte (maximale dorso-ventrale afstand in het dwarsvlak) varieert waardoor vis om te passen in de opname kamer geïllustreerd in Figuur 1. Vissen die te klein zijn kunnen zal minder waarschijnlijk om de operatie te overleven en zal een kleine ELP hebben, waardoor kleurstof plaatsing uitdagend. Vissen die te groot zijn zal een grote, over vergaande cerebellum dat de toegang tot ELA en ELP zal verminderen en kan verhinderen dat het verlagen van de hoge energie-, water-immersie objectief dicht genoeg om zich te concentreren op de ELA en Elp. Toepassing Site Dye Type Vis geprobeerd Label in ELA Label in Elp Eenheden geprobeerd Recordings ELeen Alexa Fluor injectie 32 26 (81,2%) 19 (59,4%) 50 4 (8,0%) ELA Alexa Fluor gedrenkt filtreerpapier 1 0 0 0 0 ELA Di-I in DMSO 8 6 (75,0%) 0 0 0 ELA Di-O kristallen 5 3 (60,0%) 2 (40,0%) 9 0 Elp Solid Alexa Fluor kristallen 2 0 2 (100%) 0 0 Elp Alexa Fluor coated wolfraamdraden 43 <strong> 29 (67,4%) 41 (95,3%) 119 26 (21,8%) Tabel 2. Slaagpercentage elke kleurstof injectie methode. Succes tarieven voor elke kleurstof injectie methode. Werkwijzen zijn verdeeld op basis injectieplaats en kleurstof type. In elke methode het totale aantal vissen geprobeerd en het percentage van deze experimenten dat resulteerde in succesvolle etikettering ElA en ELP weergegeven. Merk op dat de gerichte opname gebied is het tegenovergestelde van de toedieningsplaats (vetgedrukte dozen). Voor injectie werd kleurstofopname succesvol etikettering van zowel SOMA en axonen beschouwd. In tegenstelling, bij de opnameplaats alleen preparaten gemerkte axons werden geteld als succesvol labelingsexperimenten. Het totale aantal pogingen eenheden en het percentage van deze eenheden die resulteerde in succesvolle opnames worden ook getoond. # Van injectie sites Gemiddelde volume per injectie (pi) Waaier van volumes per injectie (pi) Gemiddelde totale injectie volume (pl) Bereik van de totale injectie volumes (pl) Microinjector met Hamilton 3 of 4 0.144 ,091-0,91 0.516 0,378-0,669 Nanoinjector met glazen pipet 2-4 0.069 (vaste) Vast volume geïnjecteerd 1-6 keer 0.621 0,414-0,966 Microinjector met glazen pipet 2-6 0.093 0,058-0,202 0.360 0,252-0,540 Tabel 3. Hoeveelheden kleurstof gelden bij elk van de drie methoden voor Al injecterenEXA Fluor in ELA hoeveelheden kleurstof gelden bij elk van de drie methoden te injecteren Alexa Fluor in ELA (eerste methode van tabel 2). Kleurstof injectie in ELA werd uitgevoerd met zowel een nanoinjector en een microinjector met behulp van een 33 gauge Hamilton injectienaald of een getrokken glas capillair pipet. We varieerde het aantal injectieplaatsen, het volume per injectie en de totale hoeveelheid kleurstof injectie.