תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em> בvivo</em
Summary
תחבורה מדרדר של צבע פלואורסצנטי מתייגת תת אוכלוסייה של תאי עצב המבוססים על הקרנת אנטומי. אקסונים שכותרתו יכול להיות ממוקדים מבחינה ויזואלית<em> In vivo</em>, המאפשר הקלטה תאית מהאקסונים שזוהו. טכניקה זו מאפשרת הקלטה כאשר לא יכולים להיות מתויגים הנוירונים באמצעות מניפולציה גנטית או קשים לבודד באמצעות 'עיוורת'<em> In vivo</em> גישות.
Abstract
המטרה הכללית של שיטה זו היא לרשום תגובות-יחידה אחת מאוכלוסייה מזוהות של נוירונים. בקלטות אלקטרו vivo מתא עצב בודדים הם קריטיים להבנה כיצד לתפקד במעגלים עצביים בתנאים טבעיים. באופן מסורתי, ההקלטות הללו כבר בוצעו "עיוורים", כלומר את זהותו של התא אינה ידועה נרשם בתחילת ההקלטה. זהות סלולרית ניתן לקבוע בהמשך דרך 1 תאי, juxtacellular 2 או רופף-תיקון 3 Iontophoresis של צבע, אך ההקלטות אלה לא ניתן מראש ממוקדות לתאי עצב ספציפיים באזורים עם סוגי תאים הטרוגניים תפקודיים. ניתן לבטא חלבוני ניאון באופן ספציפי תא מסוג המתיר electrophysiology תא בודד 4-6 חזותי המודרך. עם זאת, ישנן מערכות מודל רבות אשר כלים גנטיים אלה אינם זמינים. אפילו במערכות מודל גנטי נגישות, רצוי פרוmoter עשוי להיות ידוע או נוירונים גנטי הומוגניות ייתכן שדפוסים משתנים הקרנה. כמו כן, נעשו שימוש בוקטורים ויראליים לתייג קבוצות מסוימות של נוירונים הקרנה 7, אך שימוש בשיטה זו היא מוגבלת על ידי רעילות וחוסר הספציפיות טרנס הסינפטי. לפיכך, טכניקות נוספות המציעות ראיה מראש ספציפית כדי להקליט מתא עצב אחד מזוהה in vivo יש צורך. ראיה מראש של נוירון היעד היא שימושית במיוחד עבור תנאי הקלטה מאתגרים, שעבורו הקלטות של תא בודד הקלסיים הן לעתים קרובות קשה 8-11 להחריד. הטכניקה החדשנית שמתוארת במאמר זה משתמשת בתחבורה מדרדר של צבע פלואורסצנטי מיושמת באמצעות מחטי טונגסטן במהירות ובאופן סלקטיבי לתייג קבוצת משנה ספציפית של תאים בתוך אזור מוח מסוים המבוסס על תחזיות axonal הייחודיות שלהם, ובכך לספק רמז חזותי להשיג קלטות אלקטרו ממוקדות מתא העצב המזוהה במעגל withi ללא פגענה החולייתנים מערכת העצבים המרכזית.
קידום הרומן המשמעותי ביותר של השיטה הוא השימוש בניאון התיוג למקד סוגי תאים מסוימים במערכת מודל שאינו נגישה מבחינה גנטית. דגי חשמל חלש הם מערכת מודל מצוינת לחקר מעגלים עצביים בער, מתנהג בעלי חיים 12. אנו מנוצלים טכניקה זו כדי ללמוד עיבוד חושי על ידי "תאים קטנים" בגרעין exterolateral הקדמי (ELA) של דגי mormyrid חשמל חלש. "תאים קטנים" הם שערנו להיות נוירונים קומפרטור זמן חשובים לאיתור הבדלי submillisecond בזמני ההגעה של הקוצים presynaptic 13. עם זאת, תכונות אנטומיות כגון מיאלין הצפוף, סינפסות שוטפות, וגופי תא קטנים עשו את זה קשה מאוד להקליט מהתאים האלה באמצעות שיטות מסורתיות 11, 14. כאן אנו מראים כי השיטה החדשה שלנו באופן סלקטיבי תוויות בתאים אלה ב28% מהכנות, ומאפשרים להקלטות, חזקות ואמינות characterization של תגובות לגירוי electrosensory.
Protocol
Discussion
ברגע ששולט, טכניקה זו תאפשר אחד למקד נוירונים שזוהו, לרבות אקסונים בודדים, עבור בהקלטות vivo במערכות מודל רבות. בנוסף, טכניקה זו מאפשרת להקליט פלט ספייק מנוירונים עם מאפיינים אנטומיים ייחודיים ההופכים מסורתית בשיטות הקלטת vivo מאתגרות באופן מהימן. יש לנו מנוצלים בטכניקה זו כדי להקליט מ" תאים קטנים "אלה, בדגי חשמל חלש mormyrid. הניסיונות קודמים כדי ללמוד את מאפייני הכוונון של "תאים קטנים" לא צלחו בשל תנאים מאתגרים הקלטה 11, 14. תכונות אנטומיות דומות ליצור חסמים להשגת הקלטות יחידה אחת מחוליות רבות שמיעתי שונה ו8-10 נוירונים electrosensory. כדי להתגבר על האתגרים אלה במערכת שלנו, אנו ניצל את העובדה כי "תאים קטנים" הם התאים היחידים בELA כי פרויקט לELP. לפיכך, תחבורה מדרדר של צבע להציב ELP מגבילה תיוג בELA ל" קטןsomas התא "ואקסונים. תיוג ניאון של אקסונים אפשרו מיקום האלקטרודה מדויק ליד אקסונים שכותרתו, ביצוע הקלטות יחידה אחת מחוליות מזוהות אפשריות למרות somas נגיש. אנחנו ניסינו הקלטות גופניות, אבל לא הצליח, ככל הנראה בשל את הסינפסות שיבלעו 11 שמסביב , 17. עם זאת, סומטי התיוג היה נראה בבירור שמראה כי טכניקה זו יכולה לשמש יעד הקלטות הסומטיים בסוגי תאים אחרים ומעגלים אחרים. תיוג פלורסנט של הנוירונים באמצעות תחבורה מדרדר in vivo שימש במשך מנחה הקלטות ממוקדות במבחנה 19-21 . טכניקה דומה שימש לממוקד בהקלטות vivo מהנוירונים מוטוריים בחוט השדרה 22 דג הזברה. העבודה שלנו מייצגת התרחבות רומן של גישה זו, שבה גם תיוג וההקלטה נעשים in vivo בתוך המוח. השיטה שלנו מוכיחה כי in vivo תיוג של אזורים במערכת העצבים המרכזית עם לא מדרדרניתן להרחיב רוכב לחקר מעגלים שלמים אחרים עם נוירונים הקרנה דומה סלקטיבית. לדוגמה, בעיבוד שמיעתי יונקים, colliculus הנחות (IC) משמש כמרכז חשוב לממסר תשומות ממבנים מרובים rhombencephalic 23. זריקת צבע לתוך IC הייתי סלקטיבי לתייג תאי הקרנה מכל אחד מגרעינים אלו. Colliculus מעולה (SC) משרת פונקציה דומה לחזון 24. הכנות בעמוד השדרה מתאימות במיוחד גם לטכניקה זו, כפי שניתן לגשת בקלות בחוט השדרה, הזרקת צבע יכולה להתרחש רחוק מהאתר של ההקלטה, וזה יכול להיות בשילוב עם הקלטה תאית ומילוי של נוירונים בחרו לרכוש מידע אנטומי מפורט יותר 25. לבסוף, בדרכי-Tracing הוא טכניקה מבוססת היטב בשימוש לאורך מערכת העצבים המרכזית כדי למפות מעגלים מורכבים 26. יכולה להיות מנוצל השיטה שלנו להוסיף מידע פונקציונלי למחקרים הללו כפי שנעשה wמדדים בסידן רגיש ith בקליפת ראיית חתול 27.
הניתוח, אשר הוא מבוסס היטב, אמין, ומשמש באופן קבוע לעיוורים in vivo הקלטות 16, יש להשלים עם דימום מינימאלי ולא נגרם נזק לפני השטח של המוח כדי לאפשר לבעלי החיים ורקמות על מנת לשרוד. בעזרת תרגול, ניתן להשלים את יישום הניתוח ולצבוע ב30-45 דקות. אנחנו שכותרתו "קטנים האקסונים תא" בהצלחה ב67% מההכנות. רוב ההכנות רק 1 או 2 אקסונים שכותרת נראים לעין, אבל כמה יש רבות כמו 8. מיחידות 119 שכותרתו ניסו, השגנו הקלטות-יחידה אחת מ -26 יחידות שחולקו מעל 12 הכנות (טבלה 2). לפיכך, הנתונים נאספו מ -41% מתכשירי האקסונים שכותרת לשיעור הצלחה כולל של 28%.
ההיבט הקריטי של יישום לצבוע תיוג עומק. החדרה רדודה של חוט טונגסטן תגרום לצבע להיות דהוי AWאיי. עם זאת, אם החדירה היא עמוקה מדי, האקסונים שכותרתו לא יהיו גלויים למיקוד. יתר על כן, כמה נזק מכאני לתא חייב להתרחש לצבע שיש לנקוט במידה מספקת עד 25, 28. עם זאת, נזק רב מדי יהרוג את התאים. אנחנו ניסינו תיוג עם צבעים אחרים ושיטות אחרות (טבלה 2), כוללים תיוג אנטרוגדית באמצעות הזרקת צבע לתוך ELA יחד עם הקלטה מהאקסונים שבכותרת ELP (לוח 3). אנו משערים כי תיוג אנטרוגדית לא היה מוצלח בגלל התיוג היה מוגבל לתאים עם נזק גופני, מה שהופך אותם להגיב. בנוסף, מסופים מראש סינפטיים ייתכן שיפריעו לו. בניגוד לכך, תיוג מדרדר ממזער את שני חששות אלה. הכמות והמיקום של יישום צבע יכולים להיות שונה בהתאם למעגל המסוים הנלמד. תיוג מקסימאלי מתרחש עם ריכוז הצבע הגדול ביותר, שהשגנו באמצעות חוטי טונגסטן מצופים. עם זאת, לתיוג אקסונים עם דהתחזיות EP, צבע עלולה לרדת מחט טונגסטן כפי שהוא מתקדם. במקרים אלה, הזרקה בלחץ תהיה מתאימה יותר. ספיגה והובלת דאי הן מהיר, עם אקסונים שכותרתו בהכנה שלנו להיות גלוי מוקדם ככל 2 שעות לאחר ההזרקה ואקסונים נוספים שכותרתו מופיעים מאוחר ככל 6 שעות לאחר ההזרקה. לכן, יכולים להיות מושלם תיוג וההקלטה ביום אחד, ומבטלים קשיים טכניים הקשורים לניתוח הישרדות. עיתוי ישתנה עבור כל יישום בהתאם למרחק הנדרש להובלת צבע.
עוד היבט קריטי הוא מיקום האלקטרודה. חשוב להיכנס לרקמות קרובים לאתר של האקסון שכותרתו כדי למנוע סתימה של הקצה. לרקמה צפופה כמו בELA, שוק ארוך, דק על האלקטרודה ההקלטה ממזער תנועה עודפת של רקמה הסובבת. אם הקלטה מוצלחת לא תושג בניסיון הראשון, חזרו עם אלקטרודות טריות עד הקלטה מתקבלת או TissUE מופר לנקודה שבה האקסון הוא כבר לא נראה לעין. עם זאת, חשוב גם למקם את האלקטרודה ליד האקסון במהירות כדי לצמצם את כמות חשיפת ניאון, אשר יכול לגרום phototoxicity, הלבנת ועשויה להשפיע על תכונות פיסיולוגיות של תא 29-31.
ברגע שקטע של האקסון הוא שואב בהצלחה לאלקטרודה ההקלטה, ניתן להשיג הקלטות במשך כמה שעות. אם יחידות הולכות לאיבוד באופן עקבי בפחות משעה 1, לשקול ביצוע טיפים אלקטרודה קטנים יותר כדי למנוע את האקסון ממחליק החוצה. מצד השני, קטנה מדי מקצה עלול לגרום לסתימה, אות לרעש, או נזק נמוך לאקסון. ירידה מתמדת בספייק משרעת ו'השיבה 'של יחידה עם יניקה נוספת היא אינדיקציה לכך שהטיפ הוא גדול מדי. יותר מדי יניקה עלולה לגרום לניזק בלתי הפיך לאקסון. פתרון אחד הוא לאפשר דליפה קטנה בקו האוויר ולכן הלחץ לאט חוזר לאפס. מהירות השוואת הלחץ דואר יגרום "לדחוף" ביחס כלפי חוץ חולף שעלולים לגרש את האקסון.
למרות שטכניקה זו מהווה יתרון גדול עבור השגת הקלטות מתא עצב הקרנה ממוקדות שזוהה, זה לא יהיה שימושי להבחנה interneurons המקומי, כצבע יהיה תפוס על ידי כל סוגי התאים באזור ההזרקה. תיאורטית, השימוש בfluorophores מרובים עם אתרי הזרקה נפרדים עשוי לאפשר לשיטה זו יש להרחיב. לדוגמה, השוואה של יחיד לעומת כפול תיוג יכולה לשמש כדי להבדיל interneurons מנוירונים ההקרנה הבאים זריקות כפולות בשתי נקודות במעגל 32. כמו כן, ניתן לשלב קליעים נותבים מדרדר עם טכניקות הדמיה מתקדמות אחרות, כגון הדמיה שני פוטונים, כפי שנעשה לאחרונה בזברה פינק גבוה ווקאלית המרכז (HVC) 32. כמו כן, אזורי רישום מוגבלים לאלה קרובים לפני השטח בעת שימוש במיקרוסקופי epifluorescence, כפי שהיינו רק מסוגל לפתור 1 μ מבנים מ 'בתוך 30 מיקרומטר הראשון של רקמה. עם זאת, עומק זו ניתן יהיה להרחיב באמצעות השימוש בשיטות מיקרוסקופיה אחרות, כגון שני פוטונים במיקרוסקופ 33 או אובייקטיבי מצמידי מיקרוסקופיה תאורת מישורי 34. בסך הכל, בטכניקה זו מייצגת התקדמות חשובה בחקר מעגלים העצביים in vivo, כי זה יכול לשמש כדי להקליט מתא עצב בודד במעגלים שונים רבים במגוון רחב של מערכות מודל – כולל אלה שאינם נגישים באופן יחסי.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון הניתן על ידי הקרן הלאומית למדע (IOS-1,050,701 לBAC), המכונים הלאומי לבריאות (NS54174 לSM וF30DC0111907 לAML-W.), קרן זכרון Uehara ויפן אגודה לקידום מדע (G2205 לTK ). אנו מודים למיקס ג'וליאן על תמיכתו והדרכה בנושא של הקלטות axonal תאית. אנו מודים קארל הופקינס למתן חדר הקלטת אב טיפוס.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Tricaine Methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| Gallamine Triethiodide | Sigma-Aldrich | G8134 | Flaxedil |
| Lidocaine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | |
| Hickman’s Ringer Solution | NA | NA | NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l) |
| Peristaltic Pump | Gilson or Rainin | Minipulse 3 Model 312; RP-1 | 10.0 ± 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter |
| Dissection Microscope | Nikon | SM2645 | |
| Super Glue | Super Glue Corporation | SGH2 | 2g tube |
| Omni Drill 35 | World Precision Instruments | 503-598 | |
| Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | 0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm) |
| Low Temp Cautery Kit | World Precision Instruments | 500391 | |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Dextran Conjugated Alexa Fluor 568 | Invitrogen | D-22912 | 2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings |
| Epifluorescent Microscope | Nikon | E600 FN | A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter – or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths |
| Low Power Objective | Nikon | 93182 | CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm |
| High Power Objective | Nikon | 93148 | CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm |
| White Light Source | Dolan-Jenner | Model 190 | Fiber Optic Illuminator |
| Fluorescent Light Source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | |
| Low-light Level Camera | Photometrics | CoolSnap ES | |
| Digital Manometer | Omega Engineering | HHP-201 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV-7B | Axon Instruments |
| Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | Axon Instruments |
| Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Axon Instruments |
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: ‘0’, Velocity: 60, Time: 90 Box filament |
| Pipette Glass | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID) |
References
- Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus. J. Physiol. 566, 425-441 (2005).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo–a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).
- Margrie, T. W. Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo. Neuron. 39, 911-918 (2003).
- Lima, S. Q., Hromádka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, e6099 (2009).
- Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons. J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).
- Lehman, M. N. Herpes simplex virus as a transneuronal tracer. Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).
- Joris, P. X. A dogged pursuit of coincidence. J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).
- Heiligenberg, W., Rose, G. Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia. J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).
- Morales, E. Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS. Pflügers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).
- Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish. J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).
- Hitschfeld, &. #. 2. 0. 1. ;. M., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish. ILAR. J. 50, 361-372 (2009).
- Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish. J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).
- Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior. J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).
- Carlson, B. A. Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior. J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).
- Mugnaini, E., Maler, L. Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis. Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).
- Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection. J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).
- Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system. Brain Res. 486, 334-339 (1989).
- Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex. Nature. 310, 498-500 (1984).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457, 1133-1136 (2009).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).
- Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. Dissecting the circuitry of the auditory system. Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).
- Wurtz, R. H., Albano, J. E. Visual-motor function of the primate superior colliculus. Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).
- O’Malley, D. M., Zhou, Q., Gahtan, E. Probing neural circuits in the zebrafish: a suite of optical techniques. Methods. 30, 49-63 (2003).
- Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
- Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
- Gahtan, E., O’Malley, D. M. Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish. J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).
- Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice. J. Physiol. 550, 159-167 (2003).
- Mennerick, S. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).
- Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons. J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).
- Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning. Nature. 463, 948-952 (2010).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy. Neuron. 57, 661-672 (2008).
