逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で></em

1。染料でコーティングされた針を準備電解160μmの直径のタングステンワイヤー15をシャープに。ファイナル針先端径は5-50ミクロンの範囲であるべきである。必要な針数は、標識されたされている領域の大きさに依存します。我々は後部exterolateral核（ELP）に3-5注射用5針を用意しました。 実験前の夜は、各針の先端が100μmに2mMのデキストラン共役アレクサフルーア10,000 MW色素の低下（<0.25μL）を配置。 針が先端に集中染料を残して、室温で空気乾燥させ。 4℃で光からそれらを保護するために暗い容器に針を保管してください。 2。手術のために動物を準備水槽の水が300ミリグラム/ L MS-222の溶液中に魚を配置することによって全身麻酔を誘発する。 魚や測定フォーク長（尾鰭のフォークに鼻の先端）とボディの深さ（最大背ventraを秤量横断面におけるL距離）。これらの測定は、魚が水浸系顕微鏡対物レンズ（ 図1）の下に配置するのに十分小さい記録チャンバ内に収まるように、表1に示す範囲内に入るべきである。 固定化と電気的に背ボディ筋肉組織に3 mg / mlのflaxedilを100μlを注入することにより、魚を沈黙。 タンク水で記録室（ 図1A）を記入してください。室の中心（ 図1）プラットフォーム上で魚腹側を下に置きます。魚の口の中に配置されたピペットチップ（1-2 ml /分）を使用して、100 mg / Lで、MS-222の通気ソリューションを提供します。体（ 図1C）の両側に配置ワックスで固定棒で魚を安定させる。眼の血管と正常なボディカラーで連続血流をチェックして、魚の健康状態を監視します。 その長軸に沿ってプラットフォームを回転させplatfのバックエンドを下げる魚の体の残りの部分は沈めたまま魚の頭部の背面の一側は、水の上方に露出するようにORM。キムワイプの小片を乾燥を防ぐために、皮膚の任意の非沈め部に載置されるべきである。 3。手術（ 図2） ここで説明する基本的な外科的処置は十分に確立し、確実にmormyrids 16におけるin vivoの録音でブラインドのために使用されます。他のアプリケーションでは、ラベリングと記録するため所望の領域を公開します。目的の細胞の軸索末端を含む領域は、染料でコーティングされた針で到達可能である必要があります。それらの同じ軸索のより近位のセグメントを含む領域は、水浸レンズ（この例では2ミリメートル）の作動距離に対応するために、組織上に十分なスペースを持っている必要があります。 Q-ティップを使用して、ヘッドの露出面にリドカイン0.4％溶液を適用します。 手術用メスの刃を使用し、皮膚の矩形部分の周囲をカット。ピンセットを使って長方形を削除します。四角形のサイズは、魚のサイズが調整されますが、約3mm 6.2センチメートル魚（ 図2A）のためのX 5 mmでなければなりません。長方形の横方向のエッジが目の中心に合わせるべきで、長方形の前縁には、目にはただ後方であるべきであり、長方形の内側縁は、魚の正中線のすぐ横にする必要があります。 さらに2.5 mm角の非重複面積（ 図2B）を公開する前内側方向にさらさ頭蓋骨地域を展開します。 完全に面（ 図2C）を乾燥させるために余分な組織とキムワイプと強制空冷を削り取るためにメス刃を用いて頭蓋骨の露出面をクリアして、乾燥させます。 スーパー接着剤を使用した前内側さらさ頭蓋骨領域に接着剤金属ポストを。接着剤は（ 図2D）完全に乾くまで待ちます。 </李> 6.2センチメートル魚のために頭蓋骨、約2mm X 4mmの長方形を削除します。長方形の周囲を薄くする〜0.5ミリメートル直径ボールミルカーバイドチップで歯科用ドリルを使用してください。その後、メスや鉗子使用して、基本的な脳を露出するために長方形の周囲をカットし、それを剥がれ。追加の掘削や小さなハサミで切断が完全にELを（ 図2E）を公開する必要があるかもしれません。筋出血が発生した場合、電気焼灼装置を使用することができる。 硬膜（色素沈着）と春のはさみや針を用い軟膜（クリア）の両方を切り取ると鉗子一対の切り込み部分を除去。 exterolateral核（EL）の前部と後部の部分は、今ではそれぞれELAとELP、（ 図3A）表示されます。 4。近郊の軸索の逆行性標識 interesの軸索を含む標的領域の上に染料でコーティングされた針（ステップ1で作成した）とマニピュレータを置き我々の場合ELPにおけるT、。 迅速に組織に針約25μmのを挿入します。すべての染料がオフに来たまで15-30秒待ってから、針を引っ込める。 色素が標的領域全体に分散されるように別の場所にそれぞれを配置し、必要に応じて追加の新鮮な針で繰り返します。我々は準備当たり3-5針を使用していました。 ヒックマンのリンゲル液で空洞から余分な染料を洗い流す。 染料の取り込みと輸送のために少なくとも2時間待ちます。 5。近郊の軸索の可視化直立、固定ステージ落射蛍光顕微鏡の目的の下に、魚と一緒に、記録室を配置します。魚の体が光の浸透を塞ぐように、両方の白と蛍光灯光源は上から来なければなりません。頭蓋骨の空洞上記光ファイバ光源の注意深い配置は十分な明視野画像を可能にします。落射蛍光表示、蛍光フィルター用仕様は、色素の吸収/発光スペクトルと一致する必要があります。 新鮮な水槽の水に呼吸を切り替え、同じ流量を維持する。露出した脳のキャビティ内にアース線を配置し、記録ヘッドステージのグランドに接続する（6.3参照）。 尾の付け根に次の記録一対の電極を配置し、電子オルガンの排紙コマンド（EODC）を監視する差動増幅器と記録装置（ 例えば、オーディオモニタ、オシロスコープ、またはコンピュータ）に接続する。魚が麻酔から回復した後、EODCは魚の状態の指標として用いることができる。 低倍率で見て脳領域のスケーリングされたスケッチを準備します。唯一の高倍率（ 図3D）の下に表示ラベル軸索の正確な位置を特定するためにランドマーク（魚から魚に変更になる場合があります）などの主要な血管を含む。 染料の配置を確認してください。最初のオリエンテーションのために明視野照明と全体の組織を表示（ <stronグラム>図3A）。その後、蛍光灯照明（ 図3B）で表示します。 ELPは、びまん性ラベル（ 図3Bおよび3C）を持つことになります。色素の光力学と光毒性の影響を制限するために蛍光励起を最小限に抑えます。 高倍率下ELAを検索するランドマークとして船舶を使用してください。表面付近のラベル軸索を捜している間蛍光灯で照らす。 （ 図4）。 6。外活動を記録 1ミリメートルOD、フィラメントと0.58ミリメートルIDホウケイ酸ガラスキャピラリーを用いた吸引記録電極を引き出します。理想的なチップサイズは、我々の場合には17 0.1〜0.2μmで、ターゲット軸索の直径に依存することになる。我々のアプリケーションの場合は、電極先端の直径は1.5だった±0.4ミクロン（範囲：1.0から2.4μm）を5ミリメートルの細長いシャンクと周囲の密集組織を移動せずにラベルの付いた軸索をアプローチするためである。 電気を埋めるフィルタリングヒックマンのリンゲル液でtrodes。最終的なチップ抵抗は、45.2±38.0MΩ（：16から155MΩレンジ）です。 圧力ポートと電極ホルダに電極を置き、マニピュレータに搭載されたアンプのヘッドステージに接続します。圧力ポートから圧力計とそれぞれ、圧力を監視し、制御するための注射器で終わるT字路への圧力ラインを実行します。 アンプヘッドステージとアナログ·デジタル取得装置を接続します。 電極線で30ミリバール外側に圧力で、ラベルの付いた軸索の隣に電極を配置します。イメージングソフトウェアとインターフェイスで接続低照度レベルカメラは、ピペットの配置を視覚化するために使用される。組織表面付近に起動し、軸索に向かって電極を進める。あなたが軸索に近づくと、外向きの圧力が軸索のわずかな、しかし顕著な動きを起こすべきである。 電極が強力な軸索 ​​、（ 図4A、トップ）レコードの横にある間テスト刺激（; 図1A私たちのケースでは、我々は20 MV / cmのの強度で100ミリ秒単相性の正と負の横方向のパルスを使用）を提示しながら電極でのIAL。電気アーティファクトが正しい記録/刺激（ 図4A、ボトム）を確認ものの、活動電位が観察されるべきではない。 電極外側に圧力を解放し、刺激/録音を繰り返します。活動電位は、まだ（ 図4B）が観察されるべきではない。 電極を繰り返し刺激/記録にわずかに（125±25ミリバール）吸引を適用します。活動電位は、現在の刺激（ 図4C）に対応して観察されるべきである。自発的な活動も発生することがあります。活動電位が観察されていない場合は、もう一度わずかな圧力、わずかに電極を移動し、試行吸引電極をクリアし、吸引力を解放します。活動電位が表示されていたら、圧力ラインを閉じます。 などを刺激し、記録希望。 7。終了および廃棄必要なすべての録音が完了したらEODCが停止するまで、100 mg / LでMS-222と呼吸に切り替えます。いいえEODCは、少なくとも10分間検出するべきではありません。 制度的なガイドラインと承認された動物のケアのプロトコルに従って魚を廃棄。 8。代表的な結果私たちの特定のアプリケーションのために、我々は中央の感覚ニューロンによってコーディング刺激を勉強に興味を持っています。標識された軸索から正常に記録が感覚刺激18に単体応答の分析を可能にする。 図5Aは 、記録チャンバの左右の壁の内側に位置する双極型電極を用いて横electrosensory刺激により誘発される代表的な活動電位を示す。スパイク時間はスパイクラスタプロット（ 図5B）として提示することができる。 25ミリ秒前刺激記録風OWは、自発的な活動の低レベルを示しています。この特定のELA "小細胞"はロングパス刺激持続時間が増加します（ 図5C）として繰り返し当たりスパイクの数を増やし、6 MV / cmで刺激強度で刺激時間に同調されている。平均最初のスパイクレイテンシは4.28±0.16ミリ秒、ELA 11の小さな細胞の予想待ち時間と一致しています。 図1。固定ステージepiflourescent顕微鏡の目的の下に収まることができる記録室の仕様。トップ、サイドとバックビューを示すプレキシガラスから作られた（）へスケール平方記録室。周囲の刺激電極（アスタリスク）のペアのセットは、横方向（赤·黒​​）または縦のどちらか（青 – 黄）刺激を可能にします。中央（オレンジ）、内ゴムライニング穴と隅にプレキシガラスの追加部分、一定の水位を維持し、吸引ピペットを保持しています。チャンバーの底にねじ込まつの垂直ステンレスポスト（緑色）アジャスタブルディスククランプを介して魚を（ライトグレー、Cで詳述）をサポートしているプラットフォームに接続されているステンレス製の支柱（緑色の輪郭）に接続します。室の写真をツースケール図面の下に表示されます（B）円形のプラスチックのディスククランプの個人および組み立てられたビューは垂直ポストにプラットフォームを固定するために使用される。各ディスククランプはねじ締めのためのポストと中心穴用の溝を（緑）があります。溝は互いに直交するように、ディスク·クランプ回転させる。プラットフォームのさらなる垂直および回転運動を防ぐために、ネジ（赤）クランプの場所で記事を締め。場所で魚を保持するために使用されるプレキシガラスプラットフォームの（C）フロントとサイドにスケールのビューが。プラットフォームは、木製DOWEを保持しているパラフィンワックス層（青色）で被覆されている魚をサポートするための場所でLS（黒いバー）。魚をrespiratingためのチューブは、魚の口の中に置かれたピペットチップでプラットフォームと両端の 'ヘッドボード'の穴を通過する。ステンレススチールヘッドのポストは（灰色のバー）360度の回転を可能にボールジョイントを介してプラットフォームに接続します。ステンレス鋼水平支柱（緑）は、プラットフォームのいずれかの端にねじ込まれる。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。 図2。手術の概略は、頭の背面を見下ろし。（A）は 、皮膚の長方形のピース（赤）を除去するために、順番に示されている4つのカットをします（B）前内側方向に追加の長方形の部分を削除するために開口部を拡張皮膚の（緑）、（C）で、残りの脂肪や靭帯をこすり落とす矢印で示したとキムワイプと強制空気で完全に表面を乾燥さとして。（D）接着剤は、ステンレス鋼のポスト、スーパー接着剤を使って頭蓋骨にメスの刃を動かす。でスケールバーは、ADにも適用されます（E）（それぞれELAとELP）、前部と後部exterolateral核を露出させ、骨（青）の長方形の部分を削除するには、順番に示されている4つのカットを作るために歯科用ドリルを使用して、 。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。 図3。 3時間デキストラン共役アレクサフルーア568の注入後の事後exterolateral核における蛍光標識（A）前部と後部exterolateral核は（ELAとELP、それぞれ）上から明視野照明で可視化。注意ELA内広範髄鞘形成はそれにELPからそれを区別する比較的明るい外観を与えることを確認します（B）は 、同じ領域がTRITCフィルターを通して見落射蛍光を用いて可視化した。Bについて（明）と赤のために青使って（C）の合成画像唯一の高倍率（血管の正確な位置の下に表示ラベル軸索の正確な位置を特定するために目印として使用することができ、主要な血管（赤線）を含む、ELAとELPの縮尺図面の（TRITC）（D）例）魚から魚ごとに異なります。点線はELAとELPの境界を示しています（E）サンプル画像はELAで小細胞軸索と細胞体の正常なラベルパターンの範囲を示す5つの異なる調製物からTRITCフィルタを使用して取得しました。 図4。シングルユニットの細胞外記録ラベルの付いた軸索から。正圧下（）記録電極（矢頭）はELA中の標識小細胞軸索（上）に隣接して配置され、100ミリ20 MV / cmの相性に応じてのみエッジアーティファクトを（矢頭）を記録反対陽性、横方形パルス（下）。（B）電極（矢頭）から解放外側への圧力は軸索が電極に向かってわずかに移動させる（上）が、刺激（下）への回答はまだありません。（ C）わずかな負圧が刺激開始に反応して電極に軸索（上部、矢頭）と活動電位を引っ張る（下、アスタリスク）が表示されます。すべての3つのパネルの底部には、刺激の20回の繰り返しに重ね応答である。 図5。この技術を用いて代表的な結果。（5）サンプルトレース0.1ミリ秒6 MV / cmの単相、対陽性、横方形パルス刺激により誘発される活動電位を示す。（B）ラスタープロットは6時間0で刺激を受けた同ユニットは75ミリ秒の記録ウィンドウの20回の繰り返しの間にスパイク倍を示す右側にリストされている期間の範囲でMV / cmの刺激。（C）期間同調曲線は、刺激の繰り返し当たりスパイクとしてラスタに表示応答を定量化。 質量（g） フォーク長さ（cm） ボディー奥行き（センチ） 平均 2.42 6.20 1.14 標準偏差 0.64 0.52 0.18 範囲 1.2から4.0 5.5から8.4 0.9から1.6 表1。最適な体重、魚のための長さと体の深さの範囲である。最適な重量、フォーク長（尾鰭のフォークに鼻の先端）と体深さが（最大背腹横断面の距離）魚に示す記録室にフィットすることができる範囲図1。小さすぎる魚は染料配置が困難なこと、手術を生き残るために、小さなELPを持つことになりにくいかもしれません。大きすぎる魚はELAとELPへのアクセスを減らすことになり、ELAとELPに集中するのに十分近い高電力、水浸対物レンズの低下を防ぐことが、大規模で過剰遠大小脳を持つことになります。 適用部位 染料タイプ 魚試み ELA内のラベル ELPでラベル 単位は試み 録音 ELA アレクサフルーア注射 32 26（81.2パーセント） 19（59.4パーセント） 50 4（8.0％） ELA アレクサフルーアは、ろ紙を浸し 1 0 0 0 0 ELA DMSO中のジ-I 8 6（75.0％） 0 0 0 ELA ジ-O結晶 5 3（60.0％） 2（40.0％） 9 0 ELP 固体アレクサフルーア結晶 2 0 2（100％） 0 0 ELP アレクサフルーアコーティングされたタングステン線 43 <stronG> 29（67.4パーセント） 41（95.3％） 119 26（21.8％） 表2。各色素注入法の成功率。各色素注入法の成功率。方法は注射部位及び染料の種類に基づいて分割されている。それぞれの方法については、魚の総数が試みられELAとELPに成功した標識をもたらしたこれらの実験の割合が示されている。ターゲット記録領域が適用部位（太字箱）の反対であることに注意してください。注射部位については、染料取り込みは細胞体と軸索の両方のラベルで成功したと考えられていた。対照的に、記録部位に、標識軸索でのみ製剤が成功した標識実験として計数した。試行単位の総数の成功をもたらした録画これらの単位の割合も示されている。 ＃注射のSiTES 注入あたりの平均量（μL） 注射あたりボリュームの範囲（μL） 平均総注入量（μL） 総注入量の範囲（μL） ハミルトンとマイクロインジェクター 3または4 0.144 0.091から0.91 0.516 0.378から0.669 ガラスピペットを用いてナノインジェクタ 2から4 0.069（固定） 固定されたボリュームは1-6回注入 0.621 0.414から0.966 ガラスピペットを用いてマイクロインジェクター 2から6 0.093 0.058から0.202 0.360 0.252から0.540 表3。アルミニウムを注入するために使用される3つの方法のそれぞれに適用される染料の量ELA（ 表2から最初の方法）にアレクサフルーアを注入するために使用する3つの方法のそれぞれに適用された染料のELAの数量にEXAフルーア。 ELAへの色素注入のいずれか33ゲージのハミルトン注射針又は引っ張らガラスキャピラリーピペットを用いてナノインジェクタやマイクロインジェクターの両方を行った。我々は、注射部位の数、注入あたりの​​体積と染料噴射の総体積を変化させた。