Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d'enregistrement de neurones identifiés<em> In vivo</em

1. Préparer Aiguilles Dye revêtus Électrolytique aiguiser un diamètre de 15 um fil de tungstène 160. Diamètres de pointe de l'aiguille finale doit être comprise de 5 à 50 um. Le nombre d'aiguilles nécessaires dépend de la taille de la région étant marqué. Nous avons préparé 5 aiguilles pour injections 3-5 dans le noyau exterolateral postérieure (PEL). La nuit avant l'expérience, déposer une goutte (<0,25 pi) de 2 mM Fluor colorant dextran conjugué Alexa 10.000 MW sur la partie distale 100 um de chaque aiguille. Laisser les aiguilles à l'air sec à température ambiante, en laissant colorant concentré à l'extrémité. Stocker les aiguilles à 4 ° C dans un récipient foncé pour les protéger de la lumière. 2. Préparer des animaux pour la chirurgie Induire une anesthésie générale en plaçant le poisson dans une solution de 300 mg / L de MS-222 dans de l'eau du réservoir. Peser la longueur de la fourche poisson et mesure (pointe du museau à la fourche de la nageoire caudale) et la profondeur de corps (maximal dorso-Ventral la distance dans le plan transversal). Ces mesures doivent se situer dans les fourchettes indiquées dans le tableau 1 de sorte que le poisson s'adapte à l'intérieur d'une chambre d'enregistrement assez petit pour passer sous un objectif de microscope immersion dans l'eau (Figure 1). Immobiliser et faire taire électriquement le poisson en injectant 100 pi de 3 mg / ml flaxedil dans la musculature dorsale du corps. Remplir la chambre d'enregistrement (figure 1A) avec de l'eau du réservoir. Placer le poisson ventrale vers le bas sur la plate-forme au centre de la chambre (figure 1). Fournir une solution aérée de 100 mg / L de MS-222 en utilisant un embout de pipette placée dans la bouche du poisson (1-2 ml / min). Stabiliser le poisson avec des tiges fixées à la cire placée sur les deux côtés du corps (figure 1C). Surveiller la santé du poisson en contrôlant le flux sanguin continu dans les vaisseaux oculaires et une couleur normale du corps. Tournez la plate-forme le long de son axe et abaisser l'extrémité arrière de la platfORM de telle sorte que d'un côté de la face dorsale de la tête du poisson est exposé au-dessus de l'eau tandis que le reste du corps du poisson reste immergé. Un petit morceau de Kimwipe doit être placé sur la partie non immergée de la peau pour éviter le dessèchement. 3. Chirurgie (Figure 2) La procédure chirurgicale de base décrite ici est bien établie et fiable utilisé pour aveugles enregistrements in vivo dans mormyridés 16. Pour d'autres applications, d'exposer les régions souhaitées pour l'étiquetage et l'enregistrement. La région contenant terminaisons axonales des cellules d'intérêt doit être accessible par une aiguille de colorant revêtu. La région contenant des segments plus proximales de ces mêmes axones doit disposer d'un espace suffisant au-dessus du tissu pour s'adapter à la distance de travail de la lentille à immersion dans l'eau (2 mm dans notre cas). Appliquer une solution à 0,4% de lidocaïne à la surface exposée de la tête à l'aide d'un coton-tige. Utilisation d'une lame de scalpel, couper le périmètre d'une pièce rectangulaire de la peau. Retirez le rectangle à l'aide d'une paire de pinces. La taille du rectangle échelle avec la taille du poisson, mais devrait être d'environ 3 mm x 5 mm pour un poisson de 6,2 cm (figure 2A). Le bord latéral du rectangle doit être aligné avec le centre de l'oeil, le bord antérieur du rectangle doit être juste en arrière de l'oeil, et le bord médial du rectangle doit être juste latérale de la ligne médiane du poisson. Étendre la région de crâne exposé anteromedially d'exposer une somme additionnelle de 2,5 mm de la zone non-cumul carré (figure 2B). Tout à fait claire et sécher la surface exposée du crâne à l'aide de la lame d'un scalpel pour gratter les tissus et Kimwipes excès et air pulsé pour sécher la surface (figure 2C). Collez un poteau de métal de la région du crâne exposé antéro utilisant Super Glue. Attendez jusqu'à ce que la colle soit complètement sèche (figure 2D). </li> Supprimer un rectangle de crâne, d'environ 2 mm x 4 mm pour un poisson de 6,2 cm. Utilisation d'une fraise de dentiste avec un diamètre de la bille du palpeur ~ 0,5 mm moulin carbure pour fluidifier le périmètre du rectangle. Puis, à l'aide d'un scalpel et la pince, couper le périmètre du rectangle et peler pour exposer le cerveau sous-jacent. Des forages supplémentaires ou couper avec de petits ciseaux peuvent être nécessaires pour exposer pleinement EL (figure 2E). Si le saignement musculaire se produit, une électrocoagulation peut être utilisé. Coupez la fois la dure-mère (pigmentée) et la pie-mère (clair) à l'aide des ciseaux à ressort ou une aiguille et enlevez les parties découpées avec une paire de pinces. Les parties antérieure et postérieure du noyau exterolateral (EL) sont maintenant visibles, ELA et ELP, respectivement (figure 3A). 4. Marquage rétrograde des axones d'intérêt Positionner un manipulateur avec une aiguille revêtue de colorant (faite à l'étape 1) ci-dessus de la région cible contenant des axones des interest, dans notre cas PEL. Rapidement insérer l'aiguille d'environ 25 um dans le tissu. Attendez 15-30 secondes, jusqu'à ce que le colorant est venu hors tension, puis retirer l'aiguille. Répéter avec des aiguilles frais supplémentaires que nécessaire, placer chacun dans un lieu différent de sorte que le colorant est répartie dans l'ensemble de la région cible. Nous avons utilisé 3-5 aiguilles par préparation. Rincer le colorant en excès de la cavité avec la solution de la sonnerie de Hickman. Attendez au moins 2 heures pour la montée du colorant et du transport. 5. Visualisation des axones d'intérêt Placer la chambre d'enregistrement, avec le poisson, sous l'objectif d'un microscope à épifluorescence en position verticale, fixe par étape. Comme le corps du poisson obture pénétration de la lumière, des sources de lumière à la fois blanches et fluorescentes doivent provenir ci-dessus. Mise en place soignée d'une source lumineuse à fibre optique au-dessus de la cavité du crâne permet des images en fond clair satisfaisants. Pour la visualisation épifluorescence, filtre de fluorescencespécifications doivent correspondre au spectre d'absorption / d'émission du colorant. Commutateur respiration à l'eau du réservoir fraîche et maintenir le même débit. Placez un fil de masse dans la cavité du cerveau exposé et se connecter à la masse de la headstage d'enregistrement (voir 6.3). Placer une paire d'électrodes d'enregistrement à côté de la base de la queue et se connecter à un amplificateur différentiel et un dispositif d'enregistrement (par exemple moniteur audio, un oscilloscope ou un ordinateur) pour contrôler la commande de décharge de l'organe électrique (EODC). Une fois le poisson récupère de l'anesthésie, la EODC peut être utilisé comme un indicateur de l'état du poisson. Préparer un croquis à l'échelle de la région du cerveau vue à faible grossissement. Inclure les principaux vaisseaux sanguins comme points de repère (peut varier d'un poisson à l') pour identifier l'emplacement exact des axones marqués visibles seulement à fort grossissement (figure 3D). Confirmez placement colorant. Première Voir le tissu entier avec brightfield éclairage d'orientation ( <strong> Figure 3A). Puis voir avec un éclairage fluorescent (figure 3B). PEL aura étiquetage diffuse (figures 3B et 3C). Minimiser l'excitation de fluorescence à limiter les effets phototoxiques photodynamique et du colorant. Utilisez les vaisseaux comme points de repère pour localiser ELa sous fort grossissement. Éclairer avec une lumière fluorescente tout en recherchant un axone marqué près de la surface. (Figure 4). 6. Enregistrer l'activité extracellulaire Tirez électrodes d'enregistrement d'aspiration à l'aide de 1 mm de diamètre extérieur de 0,58 mm de diamètre capillaire en verre borosilicate avec filament. Taille idéale de pointe dépendra du diamètre des axones cible, qui dans notre cas est 0,1-0,2 um 17. Pour notre application, les diamètres de pointes d'électrodes étaient de 1,5 ± 0,4 um (fourchette: 1,0-2,4 um) avec un 5 mm de long, queue étroite, afin d'approcher les axones marqués sans bouger le tissu environnant dense. Remplissez electrodes avec filtre la solution de la sonnerie de Hickman. Résistance à la pointe finale est de 45,2 ± 38,0 MQ (fourchette: 16 à 155 MQ). Placer l'électrode dans un porte-électrode avec un orifice de pression et le connecter à un headstage d'amplificateur monté sur un manipulateur. Exécuter une ligne de pression de l'orifice de pression à une fin jonction en T dans un manomètre et d'une seringue pour surveiller et contrôler la pression, respectivement. Raccorder le headstage à un amplificateur et un dispositif d'acquisition analogique-numérique. Avec 30 mbar pression vers l'extérieur dans la ligne d'électrode, placer une électrode à côté d'un axone étiquetés. Une caméra de faible éclairage interfacé avec le logiciel d'imagerie permet de visualiser placement pipette. Commencez près de la surface du tissu et de faire progresser l'électrode vers l'axone. Comme vous vous approchez de l'axone, la pression vers l'extérieur devrait provoquer un mouvement légère, mais perceptible de l'axone. Alors que l'électrode est à côté de l'axone, (figure 4A, en haut) enregistrer le puissantial à l'électrode lors de la présentation des stimuli de test (dans notre cas, nous avons utilisé 100 ms impulsions transverses positifs et négatifs monophasique à une intensité de 20 mV / cm; figure 1A). Les potentiels d'action ne devraient pas être respectées, même si un artefact électrique confirme bon enregistrement / stimulation (figure 4A, en bas). Relâchez la pression vers l'extérieur dans l'électrode et répéter stimulation / enregistrement. Les potentiels d'action devraient pas encore être observées (figure 4B). Appliquer une légère (125 ± 25 mbars) d'aspiration à l'électrode de stimulation et / répétition d'enregistrement. Les potentiels d'action doivent désormais être observées en réponse à la stimulation (figure 4C). L'activité spontanée peut également se produire. Si les potentiels d'action ne sont pas respectées, libérer l'aspiration, désactivez l'électrode avec une légère pression, déplacer l'électrode légèrement, et l'aspiration de tenter à nouveau. Une fois les potentiels d'action sont visibles, près de la ligne de pression. Stimuler et enregistrer en tant quedésirée. 7. Cessation et mise au rebut Une fois que tous les enregistrements souhaités sont complets, passez à la respiration avec 100 mg / L MS-222 jusqu'à la EODC s'est arrêté. N EODC doit être détectée pendant au moins 10 minutes. Éliminer le poisson selon les directives institutionnelles et des protocoles de soins des animaux approuvés. 8. Les résultats représentatifs Pour notre application, nous nous intéressons à l'étude de mesures de relance de codage par les neurones sensoriels centrales. Bons enregistrements à partir des axones marqués permettent l'analyse des réponses, une seule unité à la stimulation sensorielle 18. Figure 5A montre les potentiels d'action représentatifs évoqués par stimulation électrosensoriel transversal utilisant des électrodes bipolaires situées à l'intérieur des murs gauche et droit de la chambre d'enregistrement. Transitoire fois peuvent être présentées comme une trame parcelle pointe (figure 5B). A 25 msec pré-stimulus vent d'enregistrementow montre le faible niveau d'activité spontanée. Cette ELa particulier "à petites cellules" est long passer à l'écoute de la durée du stimulus à une intensité de relance de 6 mV / cm, ce qui augmente le nombre d'épis par répétition avec l'augmentation de la durée de stimulation (figure 5C). La moyenne premier pic de latence est 4,28 ± 0,16 ms, compatible avec la latence attendue pour les petites cellules sein d'ELA 11. Figure 1. Spécifications pour une chambre d'enregistrement qui peuvent être glissés sous l'objectif d'un microscope epiflourescent fixe stade. (A) chambre d'enregistrement carré Pour échelle faite de plexiglas montrant des vues dessus, de côté et arrière. Ensembles paires d'électrodes de stimulation (astérisques) à la périphérie pour permettre soit transversal (rouge-noir) ou de stimulation longitudinal (bleu-jaune). Une pièce supplémentaire de plexiglas dans le coin, avec un trou garni de caoutchouc dans le centre (orange),détient une pipette d'aspiration qui maintient un niveau d'eau constant. Deux postes verticaux en acier inoxydable vissées dans le fond de la chambre (en vert) se connectent à des poteaux en acier inoxydable (contour vert) attachés à la plate-forme supportant le poisson (gris clair, détaillé dans C) via pinces de disques réglables. Une photographie de la chambre est indiqué ci-dessous le dessin à l'échelle. (B) vue individuel et l'assemblée des pinces de disques circulaires en plastique utilisés pour sécuriser la plate-forme pour les montants verticaux. Chaque pince de disque présente une rainure (vert) à un poste et un trou central pour la vis de serrage. pinces à disques sont mis en rotation de sorte que les rainures sont perpendiculaires l'une à l'autre. Serrage de la vis de serrage (rouge) les poteaux en place pour empêcher de nouveaux vertical et le mouvement de rotation de la plate-forme. (C) frontaux et latéraux vues à l'échelle de la plate-forme en plexiglas servant à maintenir en place le poisson. La plate-forme est recouverte d'une couche de cire de paraffine (bleu) qui maintient dowe boisls (barres noires) en place pour soutenir le poisson. Tuyau pour respirating le poisson passe à travers un trou dans la 'tête' de la plate-forme et se termine dans une pointe de pipette placée dans la bouche du poisson. Un poste de tête en acier inoxydable (barre grise) se connecte à la plate-forme par l'intermédiaire d'un joint à rotule permettant une rotation de 360 ​​degrés. Inoxydable messages horizontales en acier (vert) sont vissées dans chaque extrémité de la plate-forme. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 2. Vue d'ensemble schématique de la chirurgie regardant vers le bas sur la surface dorsale de la tête. (A) Faire quatre coupes, dans l'ordre indiqué, pour enlever une pièce rectangulaire de peau (rouge). (B) prolonger l'ouverture anteromedially pour supprimer une pièce rectangulaire supplémentaire de la peau (vert). (C) gratter toute la graisse ou des ligaments restants pardéplacement de la lame de scalpel, comme indiqué par la flèche et sécher complètement la surface avec Kimwipes et de l'air forcé. (D) Coller un poteau d'acier inoxydable de crâne à l'aide Super Glue. La barre d'échelle en A s'applique aux AD. (E) Utiliser une fraise de dentiste pour faire quatre coupes, dans l'ordre indiqué, pour enlever une pièce rectangulaire de l'os (bleu), exposant les noyaux exterolateral antérieure et postérieure (Ela et ELP, respectivement) . Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 3. Le marquage fluorescent dans le noyau exterolateral postérieure 3 heures après l'injection de dextran conjugué Alexa Fluor 568. (A) Les noyaux exterolateral antérieure et postérieure (Ela et ELP, respectivement) visualisées avec éclairage de champ lumineux d'en haut. Remarqueque la vaste myélinisation dans les ELa lui donne un aspect relativement brillant qui le distingue des PEL. (B) La même zone visualisée en utilisant épifluorescence vu à travers un filtre TRITC. (C) une image fusionnée au bleu A (fond clair) et rouge pour B (TRITC). (D) Exemple d'un dessin à l'échelle d'ELA et du PEL dont les principaux vaisseaux sanguins (lignes rouges) qui peuvent être utilisés comme points de repère pour identifier l'emplacement exact des axones marqués visibles que sous fort grossissement (l'emplacement exact des vaisseaux sanguins varie d'un poisson à l'). La ligne en pointillés indique la frontière entre Ela et PEL. (E) Exemples d'images acquises à l'aide d'un filtre TRITC de 5 préparations différentes illustrant une gamme de modèles d'étiquetage succès des petits axones des cellules et SOMAS sein d'ELA. Figure 4. Unitaire enregistrement extracellulaired'un axone étiquetés. (A) électrode d'enregistrement (tête de flèche) sous une pression positive placé à côté d'un petit axone des cellules étiquetées sein d'ELA (en haut) enregistre seul artefact de bord (pointes de flèches) en réponse à un 100 msec 20 mV / cm monophasique, , impulsion carrée transversale controlatéral positif (en bas). (B) relâcher la pression vers l'extérieur à partir de l'électrode (tête de flèche) provoque l'axone se déplacer légèrement vers l'électrode (en haut), mais il n'y a toujours pas les réponses à la relance (en bas). ( C) La pression légèrement négative tire l'axone dans l'électrode (en haut, tête de flèche) et des potentiels d'action en réponse à l'apparition de relance sont maintenant visibles (en bas, astérisque). Toutes les parties inférieures des trois panneaux sont des réponses superposées à 20 répétitions de la relance. Figure 5. Les résultats représentatifs en utilisant cette technique. (A) 5 traces d'échantillonsmontrant des potentiels d'action évoqués par un 0.1 msec 6 mV / cm monophasique, stimulus d'impulsion carré transversal controlatéral positif. (B) Raster graphique montrant fois pic pendant 20 répétitions d'une fenêtre d'enregistrement de 75 ms pour la même unité stimulée au temps 0 à 6 stimuli mV / cm à la plage des durées figurant sur ​​la droite. (C) courbe d'accord Durée quantifier les réponses affichées dans la trame de crampons par la répétition de relance. Masse (g) longueur à la fourche (cm) Profondeur du corps (cm) Signifier 2,42 6.20 1.14 L'écart-type 0,64 0,52 0,18 Range 1,2 à 4,0 5.5 à 8.4 0.9-1.6 Tableau 1. Optimalpoids, la longueur et le corps gammes de profondeur pour les poissons. poids optimal, longueur de la fourche (pointe du museau à la fourche de la nageoire caudale) et le corps profondeur (maximum distance de dorso-ventral dans le plan transversal) varie permettant aux poissons de s'adapter dans la chambre d'enregistrement illustré dans Figure 1. Les poissons qui sont trop petits peut-être moins de chances de survivre à l'intervention chirurgicale et aura une petite PEL, ce qui rend difficile le placement colorant. Les poissons qui sont trop volumineux aura un grand cervelet, plus grande envergure qui permettra de réduire l'accès à Ela et PEL et peut empêcher l'abaissement de la puissance, l'objectif élevé immersion dans l'eau assez près pour se concentrer sur Ela et PEL. Site d'application Type de colorant Poisson tenté Étiquette sein d'ELA Étiquette PEL Unités tenté Enregistrements ELune Alexa Fluor injection 32 26 (81,2%) 19 (59,4%) 50 4 (8,0%) ELa Alexa Fluor papier filtre imbibé 1 0 0 0 0 ELa Di-I dans le DMSO 8 6 (75,0%) 0 0 0 ELa Di-O cristaux 5 3 (60,0%) 2 (40,0%) 9 0 PEL Solide Alexa Fluor cristaux 2 0 2 (100%) 0 0 PEL Alexa Fluor les fils de tungstène enrobées 43 <strong> 29 (67,4%) 41 (95,3%) 119 26 (21,8%) Tableau 2. Le taux de réussite pour chaque méthode d'injection de colorant. des taux de réussite pour chaque méthode d'injection de colorant. Les méthodes sont répartis en fonction de site d'injection et le type de colorant. Pour chaque méthode, le nombre total de poissons tentée et le pourcentage de ces expériences qui ont abouti à l'étiquetage réussi à Ela et PEL est affiché. Notez que la zone d'enregistrement visé est l'opposé de la zone d'application (boîtes en caractères gras). Pour le site d'injection, absorption du colorant a été considéré comme un succès avec l'étiquetage des deux somas et des axones. En revanche, sur le site d'enregistrement, seules les préparations axones marqués ont été comptés comme des expériences réussies en matière d'étiquetage. Le nombre total de tentatives d'unités et le pourcentage de ces unités qui ont abouti à de bons enregistrements sont également représentées. # De si injectionTES Volume moyen par injection (ul) Gamme de volumes par injection (ul) Le volume moyen d'injection totale (ul) Gamme de volumes d'injection totale (ul) Microinjecteur avec Hamilton 3 ou 4 0.144 0,091 à 0,91 0,516 0,378 à 0,669 Nanoinjector avec pipette en verre 2 – 4 0.069 (fixe) Volume fixe injecté 1-6 fois 0,621 De 0,414 à 0,966 Microinjecteur avec pipette en verre 2-6 0.093 0,058 à 0,202 0.360 0,252 à 0,540 Tableau 3. Les quantités de colorant appliquées pour chacun des trois méthodes utilisées pour injecter AlEXA Fluor dans ELA quantités de colorant appliquées pour chacun des trois méthodes utilisées pour injecter Alexa Fluor dans ELa (première méthode du tableau 2). Injection de colorant dans ELa a été réalisée à la fois un nanoinjector et un micro-injecteur utilisant une jauge Hamilton aiguille de seringue 33 ou d'une pipette capillaire en verre tiré. Nous avons fait varier le nombre de sites d'injection, le volume par injection et le volume total de l'injection de colorant.