Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em> In vivo</em

1. Bereiten Dye-beschichtete Nadeln Elektrolytisch schärfen eine 160 Mikrometer Durchmesser Wolframdraht 15. Finale Nadelspitze Durchmesser sollte 5-50 &mgr; m liegen. Die Anzahl der Nadeln ist abhängig von der Größe der Region markiert ist. Wir bereiteten 5 Nadeln für 3-5 Injektionen in den hinteren exterolateral Kern (ELP). Die Nacht vor dem Versuch, einen Tropfen (<0,25 ul) von 2 mM Dextran-konjugierten Alexa Fluor 10.000 MW Farbstoff auf den distalen 100 um jeder Nadel. Lassen Sie die Nadeln an der Luft bei Raumtemperatur trocknen, so konzentrierte Farbstoff an der Spitze. Bewahren Sie die Nadeln bei 4 ° C in einem dunklen Behälter, um sie vor Licht zu schützen. 2. Bereiten Tier für Chirurgie Induce Vollnarkose, indem Sie den Fisch in einer Lösung von 300 mg / L MS-222 in Tank Wasser. Wiegen Sie den Fisch und Maßnahme Gabellänge (Spitze des Mauls bis Gabel Schwanzflosse) Körper und Tiefe (maximal dorso-Ventral Abstand in der Querebene). Diese Messungen sollten innerhalb der Bereiche in Tabelle 1 angegeben, so dass der Fisch in einer Aufnahme Kammer klein genug, um unter einem Wasser-Immersions-Mikroskop-Objektiv (Abbildung 1) zu platzieren passt fallen. Unbeweglichkeitseffekt und elektrisch Schweigen der Fische durch die Injektion von 100 ul von 3 mg / ml flaxedil in die dorsale Körpermuskulatur. Füllen Sie die Aufnahme Kammer (Abbildung 1A) mit Tank Wasser. Den Fisch ventralen Seite nach unten auf die Plattform in der Mitte der Kammer (Abbildung 1). Liefern eines belüfteten Lösung von 100 mg / L MS-222 mit einer Pipettenspitze in des Fisches Mund gelegt (1-2 ml / min). Stabilisieren der Fisch mit Stangen in Wachs auf beiden Seiten des Körpers (1C) angeordnet ist fixiert. Überwachen des Fisches Gesundheit, indem Sie für die kontinuierliche Blutfluss in den Augengefäße und einem normalen Körper Farbe. Drehen der Plattform entlang seiner Längsachse und Absenken des hinteren Endes des Plattform so dass eine Seite der dorsalen Fläche des Fisches Kopf über dem Wasser ausgesetzt ist, während der Rest von dem Körper des Fisches bleibt eingetaucht. Ein kleines Stück Kimwipe sollte auf einem nicht-eingetauchten Teil der Haut zu verhindern, Trocknen gelegt werden. 3. Chirurgie (Abbildung 2) Die grundlegende chirurgische hier beschriebene Vorgehensweise ist gut etabliert und zuverlässig für Blinde in vivo-Aufnahmen in Mormyriden 16 verwendet. Für andere Anwendungen, setzen Sie die gewünschten Regionen zur Kennzeichnung und Aufzeichnung. Die Region enthält Axonterminalen der Zellen von Interesse erreichbar sein muss durch einen Farbstoff beschichtete Nadel. Die Region, die mehr proximalen Segmente denselben Axone muss ausreichend Raum über dem Gewebe, um die Entfernung des Wasser-Immersionslinse (2 mm in unserem Fall) unterzubringen. Tragen Sie eine 0,4% ige Lösung von Lidocain auf die freigelegte Oberfläche des Kopfes mit einem Q-Tip. Mit einem Skalpell geschnitten den Umfang eines rechteckigen Stück Haut. Entfernen Sie das Rechteck mit einer Pinzette. Die Größe des Rechtecks ​​wird mit Fisch skalieren, sondern sollte etwa 3 mm x 5 mm für eine 6,2 cm Fisch (2A) sein. Die seitliche Kante des Rechtecks ​​mit dem Mittelpunkt des Auges anzupassen, sollte der vorderen Kante des Rechtecks ​​unmittelbar hinter dem Auge, und die mediale Kante des Rechtecks ​​sollte genau lateral des Fisches Mittellinie. Erweitern Sie den ausgesetzt Oberkopf anteromedial eine zusätzliche 2,5 mm im Quadrat nicht überlappenden Bereich (2B) freizulegen. Völlig klar und trocken die freigelegte Oberfläche des Schädels mit dem Skalpell zu kratzen entfernt überschüssiges Gewebe und Kimwipes und Druckluft, um die Oberfläche (Abbildung 2C) trocknen. Kleber ein Metall Post an die anteromedial ausgesetzt Oberkopf mit Super Glue. Warten Sie, bis der Kleber vollständig trocken ist (Abbildung 2D). </li> Entfernen Sie ein Rechteck des Schädels, etwa 2 mm x 4 mm für eine 6,2 cm Fisch. Verwenden Sie eine zahnärztliche Bohrer mit einem Durchmesser von 0,5 mm ~ Kugelmühle Hartmetallspitze, um den Umfang des Rechtecks ​​zu verdünnen. Dann, mit einem Skalpell und Pinzette, schneiden Sie den Umfang des Rechtecks ​​und ziehen sie weg, um die zugrunde liegende Gehirn freizulegen. Weitere Bohrungen oder Schneiden mit einer kleinen Schere kann notwendig sein, vollständig freizulegen EL (2E). Wenn Muskeln Blutung auftritt, kann ein Elektrokauterisation Gerät verwendet werden. Schneiden Sie sowohl die Dura mater (pigmentiert) und der pia mater (klar) mit Feder Schere oder eine Nadel, und entfernen Sie die geschnittenen Teile mit einer Pinzette. Die vorderen und hinteren Abschnitte des exterolateral Kern (EL) sind nun sichtbar, ELa und ELP, bzw. (3A). 4. Retrograde Markierung von Axonen in der Nähe Positionieren Sie einen Manipulator mit einem Farbstoff beschichtet Nadel (hergestellt in Schritt 1) ​​über dem Zielbereich enthält Axone interest, in unserem Fall ELP. Rasch die Nadel ungefähr 25 um in das Gewebe. Warten Sie 15-30 Sekunden, bis der gesamte Farbstoff hat sich gelöst, und dann die Nadel zurückziehen. Wiederholen Sie mit zusätzlichen frischen Nadeln wie nötig, indem jedes in einem anderen Ort, so dass der Farbstoff in der Zielregion verteilt wird. Wir haben 3-5 Nadeln pro Vorbereitung. Spülen Sie überschüssige Farbe aus dem Hohlraum mit Hickman-Ringer-Lösung. Warten Sie mindestens 2 Stunden für Farbstoffaufnahme und Transport. 5. Visualisierung der Axone in der Nähe Legen Sie die Aufnahme Kammer, zusammen mit dem Fisch, unter dem Ziel von einer aufrechten, festen Bühne Epifluoreszenzmikroskop. Da der Körper des Fisches verschließt Lichteinfall, müssen beide weiß und fluoreszierende Lichtquellen von oben kommen. Sorgfältige Platzierung einer Faseroptik-Lichtquelle über dem Schädel Hohlraum ermöglicht zufriedenstellend Hellfeld Bilder. Für Epifluoreszenz Viewing, Fluoreszenz-FilterSpezifikationen sollte der Absorption / Emissionsspektrum des Farbstoffs. Schalten Atmung an die frische Tank Wasser und pflegen die gleiche Strömungsgeschwindigkeit. Legen Sie ein Erdungskabel in der exponierten Hohlraum im Gehirn und an den Boden der Aufnahme headstage (siehe 6.3). Setzen eines Paares von Aufzeichnungselektroden neben der Basis des Schwanzes und eine Verbindung zu einem Differenzverstärker und Aufnahmegerät (z. B. Audio, Oszilloskop, oder Computer), um das elektrische Organ Entladebefehlssignal (EODC) zu überwachen. Nach der Fisch wieder aus der Narkose kann die EODC als Indikator des Fisches Zustand verwendet werden. Bereiten Sie eine skalierte Skizze der Hirnregion bei niedriger Vergrößerung betrachtet. Fügen großen Blutgefäße als Landmarken (kann von Fisch zu Fisch unterschiedlich), um den genauen Standort von markierten Axone sichtbar nur unter hoher Vergrößerung (3D) zu identifizieren. Bestätigen Farbstoff Platzierung. Erster Blick gesamten Gewebes mit Hellfeld-Beleuchtung zur Orientierung ( <strong> 3A). Dann mit Fluoreszenz-Beleuchtung (3B) zu sehen. ELP haben diffuse Kennzeichnung (3B und 3C). Minimieren Fluoreszenzanregung die photodynamische und phototoxische Wirkung des Farbstoffs zu begrenzen. Verwenden Sie die Gefäße als Landmarken zu ELa unter hoher Vergrößerung zu lokalisieren. Illuminate mit Fluoreszenzlicht bei der Suche nach einem markierten Axon nahe der Oberfläche. (Abbildung 4). 6. Notieren extrazelluläre Aktivität Ziehen Saug Aufnahme Elektroden unter Verwendung von 1 mm OD, 0,58 mm ID Borosilikatglas Kapillare Glas mit Faden. Ideal Spitze Größe hängt von dem Durchmesser der Ziel Axone, die in unserem Fall ist 0,1-0,2 um 17 ab. Für unsere Anwendung waren Elektrodenspitze Durchmesser 1,5 ± 0,4 um (Bereich: 1,0-2,4 um) mit einem 5 mm langen, schmalen Schaft, um markierte Axone ohne Bewegung des umgebenden Gewebes dicht gepackten nähern. Füllen elekElektroden mit gefiltertem Hickman-Ringer-Lösung. Letzter Tipp Widerstand beträgt 45,2 ± 38,0 MOhm (Bereich: 16 bis 155 MQ). Stellen Sie die Elektrode in einem Elektrodenhalter mit einem Druck-Port und verbinden Sie es mit einem Verstärker headstage auf einem Manipulator montiert. Ausführen einer Druckleitung von dem Druckanschluss zu einem T-Stück endet in einem Manometer und einer Spritze zum Überwachen und Steuern des Drucks auf. Verbinden der headstage an einen Verstärker und einen Analog-Digital-Erfassungseinrichtung. Mit 30 mbar Druck nach außen in der Elektrode Linie, legen eine Elektrode neben einer markierten Axon. Ein Low-Light-Level-Kamera eine Schnittstelle mit Imaging-Software wird verwendet, um die Platzierung Pipette zu visualisieren. Starten Sie in der Nähe der Oberfläche Gewebe und vor der Elektrode in Richtung Axon. Wie Sie das Axon zu nähern, sollte der Druck nach außen zu einer leichten, aber spürbaren Bewegung des Axon. Während die Elektrode neben dem Axon, (4A, oben) aufzeichnen potential an der Elektrode während der Präsentation Teststimuli (in unserem Fall haben wir 100 ms monophasische positive und negative Impulse quer bei einer Intensität von 20 mV / cm; 1A). Aktionspotentiale nicht beobachtet werden, obwohl eine elektrische Artefakt bestätigt korrekte Aufnahme / Stimulation (4A, unten). Lassen Sie den Druck nach außen in der Elektrode und wiederholen Stimulation / Aufnahme. Aktionspotentiale sollte noch nicht beobachtet werden (Fig. 4B) werden. Üben Sie einen leichten (125 ± 25 mbar) Absaugen der Elektrode und wiederholen Stimulation / Aufnahme. Aktionspotentiale sollte nun in Reaktion auf die Stimulation (4C) beobachtet werden. Spontane Aktivität können ebenfalls auftreten. Wenn Aktionspotentiale nicht eingehalten werden, lassen Sie die Saug-, deaktivieren Sie die Elektrode mit leichtem Druck bewegen die Elektrode leicht und versuchen erneut abgesaugt. Sobald Aktionspotenziale sichtbar sind, schließen Sie die Druckleitung. Stimulieren und notieren alsgewünscht. 7. Kündigung und Entsorgung Sobald alle gewünschten Aufnahmen abgeschlossen sind, um die Atmung zu wechseln mit 100 mg / L MS-222, bis die EODC gestoppt hat. Kein EODC sollte für mindestens 10 Minuten nachgewiesen werden. Entsorgen Sie die Fische nach den Richtlinien des Instituts und zugelassene Tierpflege Protokolle. 8. Repräsentative Ergebnisse Für unsere spezielle Anwendung, wir sind interessiert an einem Studium Stimulus Codierung durch zentralen sensorischen Neuronen. Erfolgreiche Aufnahmen von markierten Axone die eine Analyse der Single-Unit-Reaktionen auf sensorische Stimulation 18. 5A zeigt repräsentative Aktionspotentialen durch transversale elektrosensorischen Stimulation mit bipolaren Elektroden, die auf den Innenseiten der linken und rechten Wänden der Aufnahme Kammer hervorgerufen. Spike mal als Spike Raster Grundstück (5B) vorgestellt werden. A 25 ms vor Stimulus Aufzeichnung Window zeigt das niedrige Niveau der spontanen Aktivität. Diese besondere ELa "kleine Zelle" ist lange vorbei, um Reiz Dauer bei einer Reizstärke von 6 mV / cm eingestellt, die Erhöhung der Anzahl der Spikes pro Wiederholung als Reizdauer zunimmt (5C). Der mittlere erste Dorn Latenzzeit 4,28 ± 0,16 ms, die der erwarteten Wartezeit für kleine Zellen in ELa 11. Abbildung 1. Spezifikationen für eine Aufnahme Kammer, die unter dem Ziel einer festen Bühne epiflourescent Mikroskop passen. (A) Zu angelegte quadratische Aufnahme Kammer aus Plexiglas zeigt oben, seitlich und hinten gesehen hat. Gepaart Sätze von stimulierenden Elektroden (Sternchen) an der Peripherie entweder für Quer-(rot-schwarz) oder längs (blau-gelb) Stimulation zu ermöglichen. Ein zusätzliches Stück Plexiglas in der Ecke, mit einem gummierten Loch in der Mitte (orange),hält eine Saugpipette, die einen konstanten Wasserstand unterhält. Zwei vertikale Edelstahl Beiträge in den Boden der Kammer (grün) verschraubt Edelstahl Beiträge (grüne Umrandung), die an der Plattform, die die Fische (hellgrau, in C beschrieben) über verstellbare Scheibe Klemmen verbinden. Ein Foto von der Kammer unter dem to-scale Zeichnung dargestellt. (B) Individuelle und zusammengebaut Blick auf die kreisförmige Kunststoffscheibe Klemmen, um die Plattform, um den vertikalen Pfosten sichern verwendet. Jede Scheibe Klemme hat eine Nut (grün) für eine Stelle und ein zentrales Loch für die Befestigungsschraube. Disc Klemmen gedreht werden, so dass die Rillen senkrecht zueinander stehen. Anziehen der Schraube (rot) klemmt die Beiträge an Ort und Stelle zu verhindern, dass weitere vertikale und Drehbewegung der Plattform. (C) Front-und Seitenairbags to-scale Blick auf die Plexiglas-Plattform verwendet, um die Fische in Position zu halten. Die Plattform ist mit einer Schicht aus Paraffin (blau), die aus Holz dowe hält beschichtetls (schwarze Balken) an Ort und Stelle, um die Fische zu unterstützen. Schläuche zum Beatmen die Fische durch ein Loch in der "Kopfteil" der Plattform und endet in einer Pipettenspitze in des Fisches Mund gelegt. Ein Edelstahl-Kopf Beitrag (graue Balken) mit der Plattform über ein Kugelgelenk um 360-Grad-Drehung. Edelstahl horizontal Beiträge (grün) in jedem Ende der Plattform geschraubt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen . Abbildung 2. Schematische Darstellung der Operation nach unten auf der dorsalen Fläche des Kopfes. (A) Stellen Sie vier Schnitte, in der angegebenen Reihenfolge, um ein rechteckiges Stück Haut (rot) zu entfernen. (B) erweitern die Öffnung anteromedial eine zusätzliche rechteckiges Stück entfernen der Haut (grün). (C) abkratzen alle verbleibenden Fett oder Bänder durchBewegen des Skalpellklinge wie durch den Pfeil angedeutet und trocknen Sie die Oberfläche vollständig mit Kimwipes und Umluft. (D) Kleber ein Edelstahl-Beitrag auf den Schädel mit Super Glue. Maßstab in A gilt für AD. (E) mit einem Dentalbohrers bis vier Schnitte zu machen, in der angegebenen Reihenfolge, um ein rechteckiges Stück des Knochens (blau) zu entfernen, Freilegung der vorderen und hinteren exterolateral Kerne (ELA und ELP, respectively) . Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen . Abbildung 3. Fluoreszenzmarkierung in der hinteren exterolateral Nucleus 3 Stunden nach der Injektion von Dextran-konjugierten Alexa Fluor 568. (A) Die vorderen und hinteren exterolateral Kerne (ELA und ELP, respectively) visualisiert mit Hellfeld-Beleuchtung von oben. Hinweisdass die umfangreichen myelination innerhalb ELa gibt es ein relativ helles Aussehen, das es von ELP. (B) Die gleiche Fläche mit Epifluoreszenz durch einen TRITC-Filter angesehen visualisiert. (C) Eine fusionierte Bild mit blau für A (Hellfeld) und rot für B (TRITC). (D) Beispiel eines skalierten Zeichnung ELa und ELP darunter große Blutgefäße (rote Linien), die als Landmarken verwendet werden, um die genaue Lage der markierten Axone sichtbar nur unter hoher Vergrößerung (die genaue Lage von Blutgefäßen identifizieren können variiert von Fisch zu Fisch). Die gestrichelte Linie zeigt die Grenze zwischen ELa und ELP. (E) Beispiel Bilder mit einem TRITC-Filter aus 5 verschiedenen Präparaten, die eine Reihe von erfolgreichen Muster der Kennzeichnung kleinzelligem Axonen und somas in ELa erworben. Abbildung 4. Einzel-Einheit extrazelluläre Aufnahmeaus einem markierten Axon. (A) Aufnahme-Elektrode (Pfeilspitze) unter Überdruck gesetzt neben einer markierten kleinzelligem Axon in ELa (oben) zeichnet nur Rand Artefakt (Pfeilspitzen) in Reaktion auf ein 100 ms 20 mV / cm monophasischen, kontralaterale-positive-, Quer-Rechteckimpuls (unten). (B) freigeben Druck nach außen von der Elektrode (Pfeilspitze) bewirkt, dass das Axon zu wenig bewegen in Richtung der Elektrode (oben), aber es gibt noch keine Reaktionen auf den Stimulus (unten). ( C) leichter Unterdruck zieht das Axon in die Elektrode (oben, Pfeilspitze) und Aktionspotentiale in Reaktion auf Stimulusbeginn sind nun sichtbar (unten, Stern). Untere Abschnitte aller drei Platten übereinander gelegt Antworten bis 20 Wiederholungen des Stimulus. Abbildung 5. Repräsentative Ergebnisse mit dieser Technik. (A) 5 Probe Spurenzeigt Aktionspotentiale von einem 0,1 ms 6 mV / cm monophasische evozierte, kontralaterale-positive, quer Rechteckimpuls Reiz. (B) Raster Diagramm, Spike mal während 20 Wiederholungen einer 75 ms Aufnahme-Fenster für das gleiche Gerät zum Zeitpunkt 0 mit 6 stimuliert mV / cm Reize im Bereich von Laufzeiten auf der rechten Seite aufgelistet. (C) Dauer Stimmkurve Quantifizierung der Reaktionen im Raster als Spikes pro Reizwiederholrate angezeigt. Gewicht (g) Gabel-Länge (cm) Karosserie Tiefe (cm) Bedeuten 2,42 6,20 1,14 Standardabweichung 0,64 0,52 0,18 Reichweite 1,2-4,0 5,5-8,4 0,9-1,6 Tabelle 1. OptimalGewicht, Länge und Tiefe Körper reicht für die Fische. Optimale Gewichtsverteilung, Gabellänge (Spitze des Mauls bis Gabel Schwanzflosse) Körper und Tiefe (maximal dorso-ventralen Abstand in der Transversalebene) reicht damit Fische in der Aufnahme Kammer dargestellt in passen Abbildung 1. Fische, die zu klein sind, ist weniger wahrscheinlich, um die Operation zu überleben und einen kleinen ELP haben, so dass Farbstoff Platzierung herausfordernd. Fische, die zu groß sind, wird eine große, über weitreichende Kleinhirn, die Zugriff auf ELa und ELP reduzieren und kann verhindern, Senkung der hohen Strom-, Wasser-Immersions-Ziel nahe genug, um auf ELa und ELP konzentrieren. Applikationsstelle Dye Typ Fisch versucht Label ELa Label ELP Einheiten versucht Recordings ELa Alexa Fluor Injektion 32 26 (81,2%) 19 (59,4%) 50 4 (8,0%) ELa Alexa Fluor getränkten Filterpapier 1 0 0 0 0 ELa Di-I in DMSO 8 6 (75,0%) 0 0 0 ELa Di-O-Kristallen 5 3 (60,0%) 2 (40,0%) 9 0 ELP Solide Alexa Fluor Kristalle 2 0 2 (100%) 0 0 ELP Alexa Fluor beschichtete Wolframdrähte 43 <strong> 29 (67.4%) 41 (95.3%) 119 26 (21,8%) Tabelle 2. Die Erfolgsraten für jeden Farbstoff Injektionsverfahren. Erfolgsraten für jeden Farbstoff Injektionsverfahren. Methoden basieren auf der Injektionsstelle und Farbstoff-Typ unterteilt. Für jede Methode versucht die Gesamtzahl der Fische und der Anteil dieser Experimente, die in erfolgreichen Kennzeichnung in ELa und ELP Folge gezeigt. Beachten Sie, dass die gezielte Aufnahme Bereich das Gegenteil von dem Einsatzort (fett-Boxen) ist. Für die Injektionsstelle wurde Farbstoffaufnahme als erfolgreich mit Beschriftungsfeld beider somas und Axonen. Im Gegensatz dazu bei der Aufnahme vor Ort wurden nur Präparate mit markierten Axone als erfolgreich Markierungsexperimente gezählt. Die Gesamtzahl der versuchten Einheiten und der Anteil dieser Einheiten, die erfolgreich Aufnahmen geführt werden auch gezeigt. # Der Einspritzung sites Durchschnittliches Volumen pro Injektion (ul) Bereich von Volumina pro Injektion (ul) Durchschnittliche insgesamt Injektionsvolumen (ul) Reichweite von insgesamt Injektionsvolumina (ul) Microinjector mit Hamilton 3 oder 4 0.144 0,091 bis 0,91 0.516 0,378 bis 0,669 Nanoinjector mit Glaspipette 2-4 0.069 (fix) Feste injizierte Volumen 1-6 mal 0.621 0,414-0,966 Microinjector mit Glaspipette 2 – 6 0.093 0,058-0,202 0.360 0,252 bis 0,540 Tabelle 3. Die Mengen an Farbstoff für jedes der drei Verfahren verwendet werden, um Al injizieren angewendetexa Fluor in ELa Mengen an Farbstoff für jede der drei Methoden zur Alexa Fluor in ELa (Methode aus Tabelle 2) injiziert wird. Dye Injektion in ELa wurde sowohl mit einem nanoinjector und Mikroinjektor durchgeführt entweder mit einem 33 Gauge Hamilton Spritze Nadel oder ein gezapftes Kapillarpipette. Wir variiert die Anzahl der Injektionsstelle, das Volumen pro Injektion und das Gesamtvolumen der Farbstoff Injektion.