Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em> En vivo</em

1. Prepare Needles tinte recubiertos Electrolíticamente afilar un micras de diámetro de tungsteno 15 160 hilos. Diámetros de punta de aguja finales deben oscilar desde 5 hasta 50 micras. El número de agujas necesarios depende del tamaño de la región que está siendo etiquetado. Preparamos 5 agujas por 3-5 inyecciones en el núcleo exterolateral posterior (ELP). La noche antes del experimento, colocar una gota (<0,25 l) de 2 mM de dextrano conjugado con Alexa Fluor 10.000 MW tinta en los distales 100 micras de cada aguja. Permita que las agujas se sequen al aire a temperatura ambiente, dejando colorante concentrada en la punta. Guarde las agujas a 4 ° C en un recipiente oscuro para protegerlos de la luz. 2. Prepárese para la Cirugía Animal Inducir la anestesia general mediante la colocación de los peces en una solución de 300 mg / L de MS-222 en el tanque de agua. Pese a los peces y medir la longitud tenedor (la punta del hocico hasta el tenedor de la aleta caudal) y profundidad corporal (máximo dorso-ventral distancia en el plano transversal). Estas mediciones deben estar dentro de los intervalos indicados en la Tabla 1 para que el pez se ajusta dentro de una cámara de registro lo suficientemente pequeño para colocar debajo de un objetivo de microscopio de inmersión en agua (Figura 1). Inmovilizar y silenciar eléctricamente los peces mediante la inyección de 100 l de 3 mg / ml flaxedil en la musculatura dorsal del cuerpo. Llenar la cámara de grabación (Figura 1A) con tanque de agua. Coloque el pescado ventral hacia abajo sobre la plataforma en el centro de la cámara (Figura 1). Entregar una solución aireada de 100 mg / L de MS-222 usando una punta de pipeta colocada en la boca del pescado (1-2 ml / min). Estabilizar el pescado con barras fijadas en cera colocado en ambos lados del cuerpo (Figura 1C). Monitorear la salud de los peces mediante la comprobación de flujo continuo de sangre en los vasos oculares y un color normal del cuerpo. Girar la plataforma a lo largo de su eje longitudinal y baje el extremo posterior de la platfORM modo que un lado de la superficie dorsal de la cabeza del pescado se expone por encima del agua, mientras que el resto del cuerpo del pescado permanece sumergido. Un pequeño trozo de Kimwipe debe ser colocado en cualquier parte no sumergida de la piel para evitar el secado. 3. Cirugía (Figura 2) El procedimiento quirúrgico básico descrito aquí está bien establecido y utilizarse de manera fiable para ciegos en grabaciones en vivo mormyrids 16. Para otras aplicaciones, exponer las regiones deseadas para el etiquetado y el registro. La región que contiene terminales de los axones de las células de interés debe ser alcanzable por una aguja de tinte-revestido. La región que contiene los segmentos más proximales de los mismos axones debe tener espacio suficiente por encima del tejido para dar cabida a la distancia de trabajo de la lente de inmersión en agua (2 mm en nuestro caso). Aplique una solución de 0,4% de lidocaína a la superficie expuesta de la cabeza con un Q-tip. Uso de una hoja de bisturí, cortar el perímetro de una pieza rectangular de la piel. Eliminar el rectángulo usando un par de pinzas. El tamaño del rectángulo se escala con el tamaño del pez, pero debe ser de aproximadamente 3 mm X 5 mm para un pescado 6,2 cm (Figura 2A). El borde lateral del rectángulo debe alinear con el centro del ojo, el borde anterior del rectángulo debe ser justo posterior al ojo, y el borde medial del rectángulo debe ser justo lateral de la línea media del pez. Ampliar la región cráneo expuesto anteromedialmente para exponer un adicional de 2,5 mm área de no superposición cuadrada (Figura 2B). Completamente limpiar y secar la superficie expuesta del cráneo usando la hoja de bisturí para raspar y retirar cualquier tejido y Kimwipes y el exceso de aire forzado para secar la superficie (Figura 2C). Pegue un poste de metal en la región cráneo expuesto anteromedial con Super Glue. Espere hasta que el pegamento se seque completamente (Figura 2D). </li> Eliminar un rectángulo del cráneo, aproximadamente 2 mm x 4 mm para un pescado 6,2 cm. Use un taladro dental con un ~ 0,5 mm de diámetro de la bola molino de punta de carburo para diluir el perímetro del rectángulo. Entonces, usando un escalpelo y pinzas, cortar el perímetro del rectángulo y la cáscara de lejos para exponer el cerebro subyacente. Adicional de perforación o el corte con unas tijeras pequeñas pueden ser necesarias para exponer completamente EL (Figura 2E). Si se produce una hemorragia muscular, se puede utilizar una unidad de electrocauterio. Cortar tanto la duramadre (pigmentada) y la piamadre (claro) utilizando tijeras resorte o una aguja y eliminar las porciones cortadas con un par de pinzas. Las porciones anterior y posterior del núcleo exterolateral (EL) son ahora visibles, ELA y ELP, respectivamente (Figura 3A). 4. Etiquetado retrógrada de los axones de interés Coloque un manipulador con una aguja tinte recubierto (hecho en el paso 1) por encima de la región de destino que contiene los axones de interest, en nuestro caso ELP. Rápidamente inserte la aguja aproximadamente 25 micras en el tejido. Espere 15 a 30 segundos, hasta que el tinte se ha desprendido, y luego retirar la aguja. Repita el procedimiento con agujas nuevas adicionales, según sea necesario, colocando cada una en un lugar diferente para que el tinte se distribuye en toda la región de destino. Se utilizó 3-5 agujas por preparación. Enjuague el exceso de tinte de la cavidad con solución de Ringer Hickman. Esperar al menos 2 horas para la absorción de colorante y el transporte. 5. Visualización de los axones de interés Coloque la cámara de grabación, junto con los peces, por debajo del objetivo de un microscopio de epifluorescencia en posición vertical, de una etapa fija. A medida que el cuerpo del pez ocluye penetración de la luz, fuentes de luz blancos y fluorescentes deben venir de arriba. La colocación cuidadosa de una fuente de luz de fibra óptica por encima de la cavidad del cráneo permite que las imágenes campo claro satisfactorios. Para una visualización epifluorescencia, filtro de fluorescenciaespecificaciones deben coincidir con el espectro de absorción / emisión del colorante. Cambie la respiración de tanque de agua fresca y mantener la misma velocidad de flujo. Coloque un cable de tierra en la cavidad del cerebro expuesto y conecte a la tierra de la headstage grabación (ver 6.3). Coloque un par de electrodos de grabación próximos a la base de la cola y conectarse a un amplificador diferencial y dispositivo de grabación (por ejemplo, monitor de audio, osciloscopio, o un ordenador) para supervisar el comando de descarga órgano eléctrico (EODC). Después de que el pez se recupere de la anestesia, la EODC se puede utilizar como un indicador de la condición del pescado. Preparar un boceto a escala de la región del cerebro vieron a bajo aumento. Incluir los vasos sanguíneos principales como puntos de referencia (pueden variar de un pez a) para identificar la ubicación exacta de los axones marcados visibles sólo bajo gran aumento (Figura 3D). Confirme la colocación tinte. En primer lugar ver el tejido entero con iluminación de campo claro de orientación ( <strong> Figura 3A). Entonces ver con la iluminación fluorescente (Figura 3B). ELP tendrá etiquetado difusa (figuras 3B y 3C). Minimizar excitación de fluorescencia para limitar los efectos fotodinámicos y fototóxico del colorante. Utilice los vasos como puntos de referencia para localizar ELA con gran aumento. Ilumine con luz fluorescente, mientras que la búsqueda de un axón marcado cerca de la superficie. (Figura 4). 6. Registrar la actividad extracelular Tire de electrodos de registro que aspiran de 1 mm de diámetro exterior, 0,58 mm de diámetro interno capilar de vidrio de borosilicato con filamento. Tamaño de la punta Ideal dependerá del diámetro de los axones de destino, que en nuestro caso es de 0,1-0,2 m 17. Para nuestra aplicación, diámetros de punta de electrodo fueron 1,5 ± 0,4 micras (rango: 1,0-2,4 micras) con un 5 mm de largo, vástago estrecho con el fin de acercarse a los axones marcados sin mover el tejido circundante densamente empaquetadas. Rellene electrodos con filtran solución de Ringer Hickman. Pérdida de carga final consejo es 45,2 ± 38,0 mW (rango: 16 a 155 mW). Coloque el electrodo en un soporte del electrodo con un puerto de presión y conectarlo a un amplificador de headstage montado en un manipulador. Ejecutar una línea de presión desde el puerto de presión a un final unión en T en un manómetro y una jeringa para el seguimiento y control de la presión, respectivamente. Conectar el headstage a un amplificador y un dispositivo de adquisición de analógico a digital. Con 30 mbar de presión hacia el exterior en la línea de electrodo, coloque un electrodo al lado de un axón etiquetado. Una cámara de bajo nivel de luz en interfaz con software de imágenes se utiliza para visualizar la colocación pipeta. Comience cerca de la superficie del tejido y hacer avanzar el electrodo hacia el axón. Al acercarse al axón, la presión hacia el exterior debe causar una leve, pero perceptible movimiento del axón. Mientras que el electrodo está al lado del axón, (Figura 4A, parte superior) grabar el potenteial en el electrodo durante la presentación de los estímulos de prueba (en nuestro caso, hemos utilizado 100 ms monofásicos pulsos transversales positivos y negativos a una intensidad de 20 mV / cm; Figura 1A). Los potenciales de acción no deben tenerse en cuenta, a pesar de un artefacto eléctrico confirma la correcta grabación / estimulación (Figura 4, abajo). Libere la presión hacia el exterior en el electrodo y repetir la estimulación / grabación. Los potenciales de acción no deben todavía ser observados (Figura 4B). Aplique ligera (125 ± 25 mbar) aspiración al electrodo de estimulación y / repetición de grabación. Los potenciales de acción ahora deben ser observados en respuesta a la estimulación (Figura 4C). También se puede producir la actividad espontánea. Si no se observan los potenciales de acción, liberar la succión, limpie el electrodo con una ligera presión, mueva el electrodo ligeramente y aspiración vuelva a intentar. Una vez que los potenciales de acción son visibles, cerca de la línea de presión. Estimular y registrar comodeseada. 7. Terminación y eliminación Una vez que todas las grabaciones deseadas son completa, cambiar a la respiración con 100 mg / L de MS-222 hasta que la EODC se ha detenido. No se EODC debe ser detectado durante al menos 10 minutos. Deshágase de los peces según las directrices institucionales y protocolos de cuidado de los animales aprobados. 8. Los resultados representativos Para nuestra aplicación particular, estamos interesados ​​en el estudio de estímulo de codificación de las neuronas sensoriales centrales. El éxito de las grabaciones de los axones marcados permiten el análisis de las respuestas-de una sola unidad a la estimulación sensorial 18. Figura 5A muestra los potenciales de acción evocados por estimulación representativos electrosensorial transversal usando electrodos bipolares situados en el interior de las paredes izquierda y derecha de la cámara de grabación. Pico de veces pueden presentarse como un ráster parcela espiga (Figura 5B). A ms pre-estímulo viento 25 Grabaciónow demuestra el bajo nivel de actividad espontánea. Este particular ELA "células pequeñas" es largo pasar sintonizado a la duración del estímulo a una intensidad del estímulo de 6 mV / cm, lo que aumenta el número de espigas por repetición a medida que aumenta la duración del estímulo (Figura 5C). La media del primer pico de latencia es de 4,28 ± 0,16 ms, en consonancia con la latencia esperada de células pequeñas en ELA 11. Figura 1. Especificaciones para una cámara de registro que puede caber debajo del objetivo de un microscopio de epifluorescencia etapas fijo. (A) a la cámara de escala de registro cuadrada hecha de plexiglás que muestra vistas superior, lateral y trasera. Conjuntos emparejados de electrodos de estimulación (asteriscos) en la periferia permiten ya sea transversal (rojo-negro) o la estimulación longitudinal (azul-amarillo). Una pieza adicional de plexiglás en la esquina, con un agujero revestido de goma en el centro (naranja),sostiene una pipeta de succión que mantiene un nivel de agua constante. Dos postes de acero inoxidable verticales atornillados en la parte inferior de la cámara (de color verde) se conectan a los postes de acero inoxidable (línea verde) conectados a la plataforma de apoyo a los peces (gris claro, detallado en C) por medio de abrazaderas de discos ajustables. Una fotografía de la cámara se muestra a continuación el dibujo a escala. (B) vistas individuales y montados de las abrazaderas circulares disco de plástico utilizados para fijar la plataforma a los postes verticales. Cada pinza disco tiene una ranura (verde) de un poste y un agujero central para el tornillo de apriete. Abrazaderas de disco son girados por lo que las ranuras son perpendiculares entre sí. Apriete las abrazaderas de tornillo (rojo) de los puestos en el lugar para evitar nuevos verticales y el movimiento de rotación de la plataforma. (C) vistas a escala frontal y lateral de la plataforma de plexiglás se utiliza para mantener el pescado en su lugar. La plataforma está cubierta con una capa de cera de parafina (azul) que contiene Dowe de maderals (barras negras) para apoyar a los peces. Los tubos para respirating el pescado pasa a través de un agujero en la "cabecera" de la plataforma y termina en una punta de pipeta colocada en la boca del pez. Un puesto de cabeza de acero inoxidable (barra gris) se conecta a la plataforma a través de una articulación de rótula que permite la rotación de 360 ​​grados. Montantes horizontales de acero inoxidable (verde) se enroscan en los extremos de la plataforma. Haz clic aquí para ver más grande la figura . Figura 2. Esquema general de la cirugía mirando hacia abajo en la superficie dorsal de la cabeza. (A) Hacer cuatro cortes, en el orden indicado, para remover una pieza rectangular de la piel (color rojo). (B) Amplíe la apertura anteromedialmente quitar una pieza rectangular adicional de la piel (color verde). (C) Raspe la grasa o ligamentos restantesmover la hoja de bisturí tal como se indica por la flecha y secar la superficie completamente con Kimwipes y aire forzado. (D) Pegamento un poste de acero inoxidable para el cráneo usando Super Glue. Barra de escala en A se aplica a AD. (E) Use un taladro dental para hacer cuatro cortes, en el orden indicado, para remover una pieza rectangular de hueso (azul), la exposición de los núcleos exterolateral anterior y posterior (ELA y ELP, respectivamente) . Haga clic aquí para ver más grande la figura . Figura 3. Etiquetado fluorescente en el núcleo exterolateral posterior 3 horas después de la inyección de dextrano conjugado con Alexa Fluor 568. (A) Los núcleos exterolateral anterior y posterior (ELA y ELP, respectivamente) visualizado con iluminación de campo brillante desde arriba. Notaque la amplia mielinización en ELA le da un aspecto relativamente brillante que la distingue de ELP. (B) La misma zona visualizada usando epifluorescencia visto a través de un filtro TRITC. (C) Una imagen combinada con azul de A (campo claro) y rojo para el B (TRITC). (D) Ejemplo de un dibujo a escala de ELA y ELP incluyendo los vasos sanguíneos principales (líneas rojas) que se pueden utilizar como puntos de referencia para identificar la ubicación exacta de los axones marcados visibles sólo bajo una gran ampliación (la ubicación exacta de los vasos sanguíneos varía de un pez a otro). La línea punteada indica la frontera entre el ELA y ELP. (E) muestra imágenes adquiridas utilizando un filtro TRITC de 5 preparaciones diferentes que ilustran una variedad de patrones de etiquetado de éxito de los axones de células pequeñas y somas en ELA. La Figura 4. Individual-unidad de registro extracelulara partir de un axón marcado. (A) electrodo de grabación (cabeza de flecha) bajo presión positiva coloca adyacente a un axón de células pequeñas marcado en ELA (parte superior) registra sólo artefacto borde (cabezas de flecha) en respuesta a un 100 mseg 20 mV / cm monofásicos, , pulso cuadrado transversal contralateral-positivo (parte inferior). (B) Liberación de presión hacia el exterior desde el electrodo (punta de flecha) hace que el axón se mueva ligeramente hacia el electrodo (arriba), pero todavía no hay respuestas a los estímulos (abajo). ( ahora C) una ligera presión negativa tira del axón en el electrodo (superior, cabeza de flecha) y los potenciales de acción en respuesta a la aparición de estímulo son visibles (abajo, asterisco). Partes inferiores de los tres paneles son respuestas superpuestas a 20 repeticiones del estímulo. Figura 5. Los resultados representativos que utilizan esta técnica. (A) 5 rastros de muestraque muestra los potenciales de acción evocados por un 0,1 mseg 6 mV / cm monofásicos,, estímulo pulso cuadrado transversal contralateral-positivo. (B) Raster gráfico que muestra tiempos de pico durante 20 repeticiones de una ventana de grabación 75 mseg para la misma unidad estimulada en el tiempo 0 con 6 mV / cm estímulos en el rango de duraciones que figuran a la derecha. (C) Duración curva de afinación cuantificar las respuestas que aparecen en la trama como espigas por estímulo repetición. Masa (g) Tenedor Largo (cm) Profundidad del cuerpo (cm) Significar 2.42 6.20 1.14 Desviación Estándar 0.64 0.52 0.18 Alcance 1.2-4.0 5.5 a 8.4 0,9-1,6 Tabla 1. Optimalpeso, longitud y profundidad que oscila del cuerpo de los peces. peso óptimo, la longitud tenedor (la punta del hocico hasta el tenedor de la aleta caudal) y el cuerpo de la profundidad (máxima distancia dorso-ventral en el plano transversal) va permitiendo a los peces como para caber en la cámara de grabación se ilustra en la Figura 1. Los peces que son demasiado pequeños puede ser menos propensos a sobrevivir a la cirugía y tendrá una pequeña ELP, por lo que la colocación de tinte desafiante. Los peces que son demasiado grandes tendrá un gran cerebelo, más de gran alcance que reducirá el acceso a ELA y ELP y puede evitar la reducción de la potencia, el objetivo de alta inmersión en agua lo suficientemente cerca como para centrarse en ELA y ELP. Lugar de la aplicación Tinte Tipo Fish intentó Etiqueta en ELA Etiqueta en la ELP Unidades intentaron Grabaciones ELun Alexa Fluor inyección 32 26 (81,2%) 19 (59,4%) 50 4 (8,0%) ELA Alexa Fluor papel de filtro empapado 1 0 0 0 0 ELA Di-I en DMSO 8 6 (75,0%) 0 0 0 ELA Cristales Di-O 5 3 (60,0%) 2 (40,0%) 9 0 ELP Alexa Fluor cristales sólidos 2 0 2 (100%) 0 0 ELP Alexa Fluor alambres de tungsteno recubiertos 43 <strong> 29 (67,4%) 41 (95,3%) 119 26 (21,8%) Tabla 2. Las tasas de éxito para cada método de inyección de medio de contraste. Índices de éxito para cada método de inyección de medio de contraste. Los métodos se dividen con base en el sitio de inyección y el tipo de colorante. Para cada método, el número total de peces intentó y el porcentaje de estos experimentos dio como resultado que en el etiquetado éxito en ELA y ELP se muestra. Tenga en cuenta que el área de grabación dirigida es el opuesto de la zona de aplicación (cajas en negrita). Para el sitio de la inyección, la absorción de colorante fue considerada exitosa con el etiquetado de ambos somas y axones. En contraste, en el lugar de grabación, únicamente de preparados con los axones marcados se contaron como experimentos de marcaje con éxito. También se muestra el número total de intentos de unidades y el porcentaje de estas unidades que se tradujo en éxito en las grabaciones. # De inyección SItes Volumen promedio por inyección (l) Rango de volúmenes por inyección (l) Volumen de inyección total promedio (l) Rango del volumen total de inyección (l) Microinyector con Hamilton 3 o 4 0.144 0,091 a 0,91 0.516 0,378 a 0,669 Nanoinjector con pipeta de vidrio 2 – 4 0.069 (fijo) Volumen fijo inyecta 1-6 veces 0.621 0,414-0,966 Microinyector con una pipeta de vidrio 2 – 6 0.093 0,058-0,202 0.360 0,252 a 0,540 Tabla 3. Las cantidades de colorante aplican para cada uno de los tres métodos que se utilizan para inyectar AlEXA Fluor en ELA Las cantidades de colorante aplicadas para cada uno de los tres métodos que se utilizan para inyectar Alexa Fluor en ELA (primer método de la Tabla 2). Inyección de un contraste en ELA se llevó a cabo tanto con un nanoinjector y un microinyector utilizando un medidor de Hamilton aguja de la jeringa 33 o un vaso tirado pipeta capilar. Hemos variado el número de puntos de inyección, el volumen por inyección y el volumen total de inyección de tinte.