Генотипирование растений и животных образцов без предварительного очистки ДНК

1. Генотипирование Arabidopsis лица завода с Direct Protocol Чтобы начать анализ dCAPS генотипирования непосредственно на лист растения Arabidopsis, сначала сформулируем 20 или 50 мкл реакции ПЦР с использованием завод Phire Прямая PCR Kit, как описано в таблице 1. Затем вырезать 0,50 мм удар от листьев растения Arabidopsis помощью Харриса Uni-Core и Харрис резки Мат. Проведение нокаутер твердо, нажмите на передний край в ткани и поверните нокаутер вперед и назад. Нажмите на поршень, чтобы извлечь диск ударом в смесь ПЦР-реакции. Убедитесь, что образец опускается в раствор ПЦР и не прилипает к стенкам трубки. Очистите передний край в нокаутер между каждым образцом для предотвращения перекрестного загрязнения путем погружения его в 2% раствор NaClO. Нажмите на поршень вверх и вниз несколько раз и протрите передний край с чистым бумажным полотенцем. Резка мат также должны бытьпромывать между образцами. Далее, используется Thermo Scientific Piko 24-а Термоциклер и Thermo Scientific Piko ПЦР планшета для выполнения ПЦР-реакции с использованием велосипедного условиях, описанных в таблице 2. ПЦР также может быть выполнена в обычной амплификатор. После ПЦР спином вниз растительного материала. Передача 5 мкл супернатанта в новую пробирку микроцентрифуге. Добавить 4 мкл воды и 1 мкл рестриктазы, SspI. Аккуратно перемешайте и спином вниз кратко для сбора содержимого в нижнюю часть трубки. Инкубируйте реакционной смеси в течение одного часа при 37 ° C. Инактивации ферментов рестрикции путем инкубации при температуре 65 ° С в течение 20 мин. При усилении ДНК непосредственно из растительных тканей, ПЦР-продукты включают в себя завод и ПЦР-производные компоненты, которые могут помешать ферментативного расщепления ограничения. Таким образом, это может быть необходимо либо разбавленным (например, 1:2 или 1:3 в воде) или очистки продуктов ПЦР до тОн последующее пищеварение, например, с помощью подходящего коммерческого набора таких как Thermo Scientific GeneJET набора для очистки ПЦР. После ограничения пищеварения фермента, анализировать полученные фрагменты в агарозном геле. Добавить 2,5 мкл 5х буфера загрузки реакции и выполнения электрофореза в агарозном геле с 10 мкл полученной смеси. 2. Развивая специфические фрагменты ДНК с 15-летней Дубовые листья помощью разбавления протокола Для начала, нарезать 2 мм удар листьев дуба. Поместите образец в 20 мкл буфера поставляются с завода Phire Kit Прямая ПЦР. Очистите передний край в панчер и резка мат, как раньше. Раздавить лист образца с 100 мкл кончика пипетки, нажав на нее кратко от стенки трубы. В зависимости от растительного материала, разбавление протокол иногда работает лучше, без дробления образца. Побочные образцов на микроцентрифуге до тОн реакций в нижней части трубы. Супернатант может быть использован непосредственно в ПЦР, или он может быть разбавлен 1:10 или 1:100 в стерильной воде в зависимости от типа образца. Используйте 0,5 мкл в 1 мкл супернатанта или разбавления в качестве шаблона для 20 мкл ПЦР-реакции. Подготовка реакцию, как описано в таблице 1. После реакции готовят, используют Thermo Scientific Piko 24-а Термоциклер и Thermo Scientific Piko ПЦР планшета для выполнения ПЦР-реакции с использованием велосипедного условиях, описанных в таблице 2. ПЦР также может быть выполнена в обычной амплификатор. После ПЦР, добавить 5 мкл 5х буфера загрузки реакции и выполнения электрофореза в агарозном геле с 15 мкл полученной смеси. 3. Генотипирование трансгенных мышей с использованием протокола разбавления Начало разведения протокол о трансгенных мышей путем размещения 2 мм ударом мУз уха в 20 мкл буфера, содержащего 0,5 мкл DNARelease Аддитивные поставляется с Phire тканей животных Прямые Kit ПЦР. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 2 мин, затем 2 мин инкубации при 98 ° C. Побочные образцов на микроцентрифуге до реакции в нижней части трубы. Используйте 1 мкл супернатанта в качестве шаблона для 20 мкл ПЦР, полученный, как описано в таблице 3. Любой супернатант, который не будет использоваться сразу же может быть передана в новую пробирку и хранить при температуре -20 ° C. Далее, используется Thermo Scientific Piko 24-а Термоциклер и Thermo Scientific Piko ПЦР планшета для выполнения ПЦР-реакции с использованием велосипедного условиях, описанных в таблице 4. Опять же, ПЦР также может быть выполнена в обычных велосипедистов ПЦР. После ПЦР, добавить 5 мкл 5х буфера загрузки реакции и выполнения электрофореза в агарозном геле Wго по 15 мкл полученной смеси. 4. Представитель Результаты В технике dCAPS сайт рестрикции в SNP интерес либо введены или уничтожены использованием ПЦР-праймеров с одно или несколько несоответствий на ДНК-мишени. Генотипирование Arabidopsis лиц заводе был проведен с dCAPS технику непосредственно из листьев ударов. Усиленный продукты перевариваются и полученные фрагменты выявления генотипа каждого были проанализированы помощью гель-электрофореза (рис. 2). В данном примере на 160 б.п. ПЦР продуктов, содержащих сайте SNP интерес (G или аллеля) в геноме Arabidopsis были усилены от ударов листьев растений с завода Phire Kit Прямая ПЦР. Прямой праймер содержал один несоответствия в конце 3 ', создавая SspI конкретные ограничения сайта в ДНК-мишени, в которую вошли SNP интерес (аллели), но неВ других аллелей SNP (рис. 2В). Разведение протоколы необходимы для сложных растительных материалов, таких как листья дуба, благодаря высокой концентрации фенольных соединений. С помощью разбавления протокол, описанный здесь, 297 б.п. фрагмент хлорпластического ДНК амплифицировали с использованием 3-х ступенчатый протокол. Дубовый лист образцов с различной разведения показано на рисунке 3, в дополнение к положительным и отрицательным контролем. Ткань Phire животных Прямые PCR Kit работал со сложной протокол, в котором только один набор праймеров были использованы для усиления двух фрагментов с большой разницей размеров, в результате обильного выхода, как правильно подобранной продукции в 1500 б.п. для трансгенных мышей и 200 б.п. для мышей дикого типа (рис. 4). Чем слабее верхней полосы с гетерозиготных мышей связано с конкуренцией как шаблоны (аллелей) по той же пары праймеров, однако genotypING результаты однозначны. Стабильность образцов подготовлен с использованием протокола разбавления была также проверена. Результаты показывают, что разведение образцы могут храниться при температуре -20 ° С в течение не менее одного года. Кроме того, повторяется циклов замораживания / оттаивания существенно не влияет на реакцию (рис. 5). Также показана надежная усиления от уха мыши образцы тканей Phire использованием ДНК-полимеразы и прямым методом ПЦР по сравнению с горячего старта Taq полимеразы и очищенную ДНК (рис. 6). Компоненты 20 мкл реакции 50 мкл реакции Final Конц. H 2 O добавить в 20 мкл добавить до 50 мкл 2x Phire завод ПЦР-буфера 10 мкл 25 мкл 1x Грунтовка X мкл X мкл 0,5 мкМ Грунтовка B X мкл X мкл 0,5 мкМ Phire Hot Start ДНК-полимеразы II 0,4 мкл 1 мкл Образец / прямая протокола 0,50 мм удара Образец / разбавления протокола 0.5-1 мкл Таблица 1. Условия реакции ПЦР растений, используемые в настоящем протоколе. Цикл шага Температура Время Циклы Начальная денатурация 98 ° C 5 мин 1 Денатурирование Отжиг * Расширение 98 ° C X ° C 72 ° C 5 сек 5 сек 20 сек 40 Окончательное расширение 72 ° C 4 ° C 1 мин держать 1 Таблица 2. Велоспорт условия для растений PCR, используемые в настоящем протоколе. * Калькулятор Tm вoscientific.com / pcrwebtools "целевых =" _blank "> www.thermoscientific.com / pcrwebtools рекомендуется при определении Tm для праймеров для использования с Phire Hot Start ДНК-полимеразы II. рекомендуется температуры отжига праймеров ≤ 20 NT равно нижняя Tm дается WebTool. Для грунтовки> 20 NT, использовать температуры отжига на 3 ° C выше, чем нижний Tm дается WebTool. Компоненты 20 мкл реакции Final Конц. H 2 O добавить в 20 мкл 2x Phire тканей животных ПЦР-буфера 10 мкл 1x Грунтовка X мкл 0,5 мкМ Грунтовка B X мкл 0,5 мкМ Phгнев Hot Start ДНК-полимеразы II 0,4 мкл Образец / разбавления протокола 1 мкл Таблица 3. Реакция условия для тканей животных ПЦР, используемые в настоящем протоколе. Цикл шага Температура Время Циклы Начальная денатурация 98 ° C 5 мин 1 Денатурирование Отжиг * Расширение 98 ° C X ° C 72 ° C 5 сек 5 сек 20 сек ≤ 1 кб 20 сек / KB> 1 кб 40 Окончательное расширение 72 ° C 4 ° C 1 мин Держать 1 Таблица 4. Велоспорт условия для тканей животных ПЦР, используемые в настоящем протоколе. * Калькулятор Tm на www.thermoscientific.com / pcrwebtools рекомендуется при определении Tm для праймеров для использования с Phire Hot Start ДНК-полимеразы II. Рекомендуемая температура отжига праймеров для ≤ 20 NT равно ниже Tm дается WebTool. Для грунтовки> 20 NT, использовать температуры отжига на 3 ° C выше, чем ниже Tm дается WebTool. Рисунок 1. Прямая ПЦР рабочий процесс. Прямая ПЦР может быть выполнено с использованием двух альтернативных протоколов. В прямом протокол небольшое количество образца добавляют непосредственно к ПКR реакции. Разбавления протокол использует краткую предварительной инкубации шаг, прежде чем ПЦР, чтобы освободить ДНК из образца материала. Рисунок 2. Генотипирование Arabidopsis лиц растение с техникой dCAPS непосредственно из листьев ударов. A) Рисунок 2А показывает принцип анализа dCAPS выполнены. Ограничение сайте в течение SNP интерес либо введены или удалены методом ПЦР с использованием праймеров с одно или несколько несоответствий на ДНК-мишени. ПЦР-продукты перевариваются и полученные фрагменты выявить генотип каждого человека, когда анализировали с помощью электрофореза. B) 0,50 мм удары из листьев растений были помещены непосредственно в 50 мкл реакции ПЦР. 160 н ПЦР продуктов, содержащих сайте SNP (G или аллель) были усилены с помощью праймеров введения уникальный сайт SspI на А-аллель. Неочищенных продуктов ПЦР были пищеваренияТед с ферментом рестрикции SspI. Полученные фрагменты были проанализированы на 3% агарозном геле. Lane M является размер маркера; полосы и G соответствуют SNP аллелей каждого образца. Полученные результаты были подтверждены при обычном анализе ДНК экстракции с последующей ПЦР и ограничения пищеварения (данные не представлены). Негативной реакции контроль без ДНК-матрицы были включены в тест установить и запустить на отдельной агарозном геле параллельно с фактическим ПЦР перед выполнением пищеварения (данные не показаны). Рисунок 3. Разведение протокол, используя образцы листьев дуба. Разведения протокол был использован для усиления 297 б.п. фрагмент хлорпластического ДНК в дубовых листьев образцов (3-шаг протокола, отжиг при 62 ° C) при различных разведениях (1:100, 1:10, 1 : 1 и 2:1) и положительные и отрицательные конTrols [C +: положительный контроль с очищенной ДНК (Arabidopsis), C-: отрицательный контроль без ДНК-матрицы]. Образец номенклатуры представляет сайте пробы (городов в Финляндии) и образец нумерации. Рисунок 4. Генотипирование трансгенных мышей с одной парой праймеров помощью разбавления протокол. Ear тканей из девяти отдельных мышей (полосы 1-9) помещали в 20 мкл буфера для разведения в том числе DNARelease добавки. После инкубации при комнатной температуре и 98 ° C, 1 мкл супернатанта использовали в качестве матрицы в 20 мкл ПЦР-реакции. Фрагмент размерах: 1.500 BP (трансгенных) и 200 б.п. (дикого типа). Рисунок 5. Образцы, приготовленные в соответствии с разбавлением протокол стабильны в течение длительного хранения. Образцы тканей уха мыши были вкл ubated в 20 мкл буфера в том числе DNARelease Аддитивные и подвергаются повторному замораживанию / оттаиванию (полоса 1), хранят при температуре -20 ° C в течение одного года (дорожка 2), или использоваться непосредственно для ПЦР (дорожка 3). Усиливается размеры фрагмента около 900 б.п., 1500 б.п. до 3200 б.п.. Рисунок 6. Phire тканей животных Прямые PCR Kit превосходит коммерческие системы очистки ДНК в сочетании с горячим полимеразы Taq ДНК-старт. Четыре ампликонов (0.5-1.5 кб) были усилены из уха мыши тканей с помощью разбавления протокол Phire тканей животных Kit Прямая ПЦР. Для сравнения, ДНК была очищена с использованием коммерческого набора для экстракции ДНК и того же фрагмента амплификации с использованием горячего старта Taq ДНК-полимеразы в соответствии с рекомендациями производителей. Только с животными Phire ткани прямой PCR Kit были все четыре ампликонов успешно усиливаются. т "> Рисунок 7. Универсальные сравнения процесса с оценкой раза / потребляемых реагентов. Thermo Scientific прямой ПЦР подхода по сравнению с подходом выделения ДНК, подход буфере для экстракции, и подход ПЦР-буфера. Расчетное время для каждого подхода перед этапом ПЦР указано красным цветом. Thermo Scientific прямой ПЦР подход занимает всего 0-4 мин для подготовки образцов до ПЦР. Ниже каждый метод, потребленный реагентов перечислены. Thermo Scientific прямой ПЦР подход использует наименьшее количество реагентов по сравнению с другими методами. Нажмите, чтобы увеличить показатель .