El genotipado de muestras de plantas y animales, sin previa purificación del ADN

1. El genotipado de individuos de plantas de Arabidopsis con Direct Protocol Para comenzar el ensayo de genotipado dCAPS directamente en la hoja de la planta Arabidopsis, primero formular 20 o 50 mu l reacciones de PCR utilizando el Phire Plant Direct Kit de PCR como se describe en la Tabla 1. A continuación, corte un golpe de 0,50 mm a partir de una hoja de la planta Arabidopsis mediante el Harris Uni-Core y Mat Harris Cutting. Sosteniendo el pegador con firmeza, presione el borde de corte en el tejido y gire el pegador de ida y vuelta. Pulsar el émbolo para expulsar el disco punzón en una mezcla de reacción PCR. Asegúrese de que la muestra cae dentro de la solución de PCR y no se pegue a las paredes del tubo. Limpie el borde de corte de la perforadora entre cada muestra para evitar la contaminación cruzada por inmersión en solución al 2% NaClO. Presione el émbolo hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces y limpie la punta con una toalla de papel limpia. La estera de corte también debe estarenjuagarse entre muestras. A continuación, emplean un Thermo Scientific Piko 24-así Thermal Cycler y Thermo Scientific Plate Piko PCR para llevar a cabo las reacciones de PCR usando las condiciones de ciclos descritas en la Tabla 2. Las reacciones de PCR también se puede realizar en termocicladores de PCR convencionales. Después de la PCR, centrifugar el material vegetal. Transferir 5 l del sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga. Añadir 4 l de agua y 1 l de enzima de restricción, SspI. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente para recoger el contenido en la parte inferior del tubo. Incubar la mezcla de reacción durante una hora a 37 ° C. Inactivar la enzima de restricción por incubación a 65 ° C durante 20 min. Cuando amplificando el ADN directamente a partir de tejidos vegetales, los productos de PCR incluyen componentes de la planta y de PCR derivados-que pueden interferir con la enzima de digestión de restricción. Por lo tanto, puede ser necesario diluir o bien (por ejemplo, 1:02 o 1:03 en agua) o purificar el producto de PCR antes de tque la digestión posterior, por ejemplo mediante el uso de un kit comercial adecuado tal como Thermo Scientific kit de purificación de PCR GeneJET. Después de la digestión con enzimas de restricción, analizar los fragmentos resultantes en un gel de agarosa. Añadir 2,5 l de 5x tampón de carga a la reacción y realizar la electroforesis en gel de agarosa con 10 l de la mezcla resultante. 2. Amplificar fragmentos específicos de ADN de Oak 15-años de edad, hojas usando el protocolo de dilución Para empezar, cortar un punzón de 2 mm de hoja de roble. Coloque la muestra en 20 l de tampón de dilución se suministra con la Planta Phire Kit PCR directa. Limpie el borde de corte de la perforadora y una base como antes. Triturar la muestra de hoja con una punta de pipeta 100 l pulsando brevemente contra la pared del tubo. Dependiendo del material de la planta, el protocolo de dilución a veces funciona mejor sin aplastar la muestra. Haga girar las muestras brevemente en una microcentrífuga hasta tél reacciones son en el fondo de los tubos. El sobrenadante puede ser utilizado directamente en la PCR, o puede ser diluido 1:10 o 1:100 en agua estéril, dependiendo del tipo de muestra. Usar 0,5 l a 1 l del sobrenadante o dilución como una plantilla para una reacción de 20 l de PCR. Preparar la reacción como se describe en la Tabla 1. Una vez que las reacciones se preparan, emplear un Thermo Scientific Piko 24-así Thermal Cycler y Thermo Scientific Plate Piko PCR para llevar a cabo las reacciones de PCR usando las condiciones de ciclos descritas en la Tabla 2. Las reacciones de PCR también se puede realizar en termocicladores de PCR convencionales. Después de la PCR, añadir 5 l de 5x tampón de carga a la reacción y realizar la electroforesis en gel de agarosa con 15 l de la mezcla resultante. 3. Genotipado de ratones transgénicos utilizando el protocolo de dilución Empezar el protocolo de dilución en ratones transgénicos mediante la colocación de un punzón de 2 mm de la mouse oreja en 20 l de tampón de dilución que contiene 0,5 l de aditivo DNARelease suministrado con el kit de Animal Tissue Phire directo PCR. Se incuban las muestras a temperatura ambiente durante 2 min, seguido de una incubación de 2 minutos a 98 ° C. Girar las muestras brevemente en una microcentrífuga hasta que las reacciones son en el fondo de los tubos. Usar 1 l de sobrenadante como molde para una reacción de 20 l de PCR, preparado como se describe en la Tabla 3. Cualquier sobrenadante que no se va a utilizar de inmediato puede ser transferido a un nuevo tubo y se almacenó a -20 ° C. A continuación, emplean un Thermo Scientific Piko 24-así Thermal Cycler y Thermo Scientific Plate Piko PCR para llevar a cabo las reacciones de PCR usando las condiciones de ciclos descritas en la Tabla 4. Una vez más, las reacciones de PCR también se puede realizar en cicladores PCR convencionales. Tras la PCR, añadir 5 l de 5x tampón de carga a la reacción y realizar la electroforesis en gel de agarosa with 15 l de la mezcla resultante. 4. Los resultados representativos En la técnica de dCAPS el sitio de restricción en el SNP de interés o bien se introduce o se destruye usando un cebador de PCR con uno o más desajustes en el ADN diana. La genotipificación de los individuos de plantas de Arabidopsis se realizó con la técnica de dCAPS directamente de golpes hoja. Los productos amplificados se digirieron los fragmentos resultantes y revelando el genotipo de cada individuo se analizaron por electroforesis en gel (Figura 2). En este ejemplo, los 160 pb productos PCR que contienen el sitio de SNP de interés (G o alelo A) en el genoma de Arabidopsis fueron amplificados de golpes hoja de la planta con la planta de Phire Kit PCR directa. El cebador directo contenía un error de emparejamiento en el extremo 3 ', la creación de un sitio de restricción SspI-específico en el ADN diana, que incluye el SNP de interés (alelo A), pero noen el otro alelo del SNP (Figura 2B). Protocolos de dilución son necesarias para material vegetal difíciles, como la hoja de roble, debido a su alta concentración de compuestos fenólicos. Usando el protocolo de dilución descrito aquí, el fragmento de 297 pb de ADN cloroplástico se amplificó utilizando el protocolo 3-paso. Especímenes de hoja de roble con diferentes diluciones se muestra en la Figura 3, además de los controles positivos y negativos. El Animal Tissue Phire Direct Kit de PCR se empleó con un protocolo de desafío en el que se utiliza sólo un conjunto de cebadores para la amplificación de dos fragmentos con una diferencia de tamaño grande, resultando en rendimientos abundantes de ambos productos del tamaño correcto de 1.500 pb para ratones transgénicos y 200 pb para los los ratones de tipo salvaje (Figura 4). La banda más débil superior con ratones heterocigotos es debido a la competencia de las dos plantillas (alelos) para el mismo primer par, sin embargo, la genotypción los resultados son ambiguos. La estabilidad de las muestras preparadas usando el protocolo de dilución también fue probado. Los resultados muestran que las muestras de dilución se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos un año. Además, repetidos ciclos descongelación / congelación no afectó significativamente la reacción (Figura 5). También se muestra la amplificación robusta de las muestras de tejido de la oreja de ratón usando la polimerasa de ADN Phire y el método de PCR directo en comparación con arranque en caliente polimerasa Taq y el ADN purificado (Figura 6). Componentes 20 l de reacción 50 l de reacción Conc. final. H 2 O añadir hasta 20 l agregar a 50 l 2x Phire Plant PCR Buffer 10 l 25 l 1x Un cebador X l X l 0,5 mM cebador B X l X l 0,5 mM Phire Hot Start II DNA Polymerase 0,4 l 1 l Muestra / Direct Protocol 0,50 mm ponche Muestra / dilución protocolo 0.5-1 l Tabla 1. Las condiciones de reacción para la Planta de PCR utilizado en este protocolo. Ciclo de Paso Temperatura Tiempo Ciclos La desnaturalización inicial 98 ° C 5 min 1 La desnaturalización Recocido * Extensión 98 ° C X ° C 72 ° C 5 sec 5 sec 20 sec 40 Extensión Final 72 ° C 4 ° C 1 min mantener 1 Tabla 2. Ciclismo condiciones para la Planta de PCR utilizado en este protocolo. * La Tm calculadora enoscientific.com / pcrwebtools "target =" _blank "> www.thermoscientific.com / pcrwebtools se recomienda para determinar la Tm de los cebadores que se utilizarán con Phire Hot Start ADN polimerasa II. La temperatura recomendada de recocido para primers ≤ 20 nt es igual a la Tm más baja dada por la herramienta web. Para cebadores> 20 nt, utilizar una temperatura de recocido 3 ° C más alta que la Tm más baja dada por la herramienta web. Componentes 20 l de reacción Conc. final. H 2 O añadir hasta 20 l 2x Phire Animal Tissue PCR Buffer 10 l 1x Un cebador X l 0,5 mM cebador B X l 0,5 mM Phira Hot Start II ADN polimerasa 0,4 l Muestra / dilución protocolo 1 l Tabla 3. Las condiciones de reacción para la PCR tejido animal utilizado en este protocolo. Ciclo de Paso Temperatura Tiempo Ciclos La desnaturalización inicial 98 ° C 5 min 1 La desnaturalización Recocido * Extensión 98 ° C X ° C 72 ° C 5 sec 5 sec 20 sec ≤ 1 kb 20 sec / kb> 1 kb 40 Extensión Final 72 ° C 4 ° C 1 min Mantener 1 Tabla 4. Ciclismo condiciones para la PCR de tejidos animales utilizados en este protocolo. * La calculadora Tm en www.thermoscientific.com / pcrwebtools se recomienda cuando la determinación de la Tm de los cebadores para ser utilizados con Phire Hot Start ADN polimerasa II. La temperatura recomendada de recocido para cebadores ≤ 20 nt es igual a la menor Tm propuesta por la herramienta web. Para cebadores> 20 nt, utilizar una temperatura de recocido 3 ° C mayor que la Tm más baja dada por la herramienta web. Figura 1. PCR directa de flujo de trabajo. Directo PCR se puede realizar utilizando dos protocolos alternativos. En el protocolo directa de una pequeña cantidad de muestra se añade directamente a la PCR reacción. El protocolo de dilución emplea una breve preincubación antes de la etapa de PCR para liberar el ADN de la muestra de material. Figura 2. El genotipado de individuos de plantas de Arabidopsis con la técnica dCAPS directamente de golpes hoja. A) La Figura 2A muestra el principio del ensayo realizado dCAPS. El sitio de restricción en el SNP de interés está bien introducido o eliminado por PCR utilizando un cebador con uno o más desajustes en el ADN diana. Los productos de PCR se digieren y los fragmentos resultantes revelan el genotipo de cada individuo cuando se analizó por electroforesis. B) 0,50 mm punzones de hojas de las plantas se colocaron directamente en 50 mu l reacciones de PCR. Los 160 bp productos de PCR que contiene el sitio SNP (G o alelo A) se amplificaron con los cebadores introduciendo un único sitio SspI para el alelo A-. Los productos de PCR fueron purificados digestiónTed con enzima de restricción SspI. Fragmentos resultantes se analizaron en un gel de agarosa al 3%. Carril M es el marcador de tamaño; carriles A y G corresponden a los alelos de SNP de cada muestra. Los resultados obtenidos fueron confirmados por análisis convencional de extracción de ADN seguido de PCR y digestión de restricción (datos no mostrados). Las reacciones de control negativo sin ADN molde se incluyeron en la prueba de configurar y ejecutar en un gel de agarosa separado en paralelo con las reacciones reales de PCR antes de realizar las digestiones (datos no mostrados). Figura 3. Protocolo de dilución utilizando muestras de hoja de roble. El protocolo de dilución se utilizó para amplificar el fragmento de 297 pb de ADN cloroplástico en muestras de hoja de roble (3-paso protocolo, hibridación a 62 ° C) a diferentes diluciones (1:100, 1:10, 1 : 1 y 2:1) y con positivo y negativocontroles [C +: control positivo de ADN purificado (Arabidopsis), C-: control negativo sin ADN plantilla]. La nomenclatura de la muestra representa el punto de recogida de la muestra (las ciudades en Finlandia) y la muestra de numeración. Figura 4. Genotipado de los ratones transgénicos con par de cebadores uno utilizando el protocolo de dilución. Tejidos del oído de nueve ratones individuales (carriles 1-9) se colocaron en 20 l de tampón de dilución incluyendo Aditivo DNARelease. Después de las incubaciones a temperatura ambiente y 98 ° C, 1 l de sobrenadante se utilizó como plantilla en la reacción de 20 l de PCR. Tamaños de los fragmentos: 1.500 pb (transgénicos) y 200 pb (tipo salvaje). Figura 5. Muestras preparadas de acuerdo con el protocolo de dilución son estables durante el almacenamiento a largo plazo. Las muestras de los tejidos del oído de ratón fueron inc ubated en 20 l de tampón de dilución incluyendo Aditivo DNARelease y se sometieron a congelación repetida / descongelación (carril 1), almacenados a -20 ° C durante un año (carril 2), o se utiliza inmediatamente para la PCR (carril 3). Los tamaños de los fragmentos amplificados fueron 900 pb, 1.500 pb y 3.200. Figura 6. Phire Animal Tissue Kit de PCR directo supera a un sistema de purificación de ADN comercial combinado con una polimerasa de ADN Taq de arranque en caliente. Cuatro amplicones (0.5-1.5 kb) se amplificaron a partir de los tejidos del oído de ratón utilizando el protocolo de dilución de Animal Phire Tissue Kit PCR directa. Para la comparación, el ADN se purificó primero utilizando un kit de extracción de ADN comercial y los mismos fragmentos se amplificaron usando un arranque en caliente, la ADN polimerasa Taq de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Sólo con la Phire Animal Tissue PCR Kit Direct fueron amplificados con éxito los cuatro amplificados. t "> Figura 7. Comparación universal del flujo de trabajo con la estimación de tiempos / reactivos consumidos. Thermo Scientific directo enfoque de PCR se compara con el enfoque de aislamiento de ADN, el enfoque de tampón de extracción, y el enfoque de tampón de PCR. El tiempo estimado para cada método antes de la etapa de PCR se muestra en rojo. El Thermo Scientific enfoque directo PCR tarda sólo 0-4 minutos para la preparación de muestras antes de la PCR. Debajo de cada método, los reactivos consumidos se enumeran. El Thermo Scientific enfoque directo PCR utiliza la menor cantidad de reactivos en comparación con los otros métodos. Haga clic aquí para ampliar la cifra .