Genotipagem de amostras de plantas e animais, sem purificação DNA Antes

1. Genotipagem dos indivíduos planta Arabidopsis com protocolo direto Para começar o ensaio de genotipagem dCAPS directamente sobre a folha da planta Arabidopsis, primeiro formular 20 ou 50 ul de reacções de PCR utilizando a Usina Phire directa PCR Kit, como descrito na Tabela 1. Em seguida, corte um soco 0,50 mm a partir de uma folha da planta Arabidopsis usando o Harris Uni-Core e Harris esteira de corte. Segurando o perfurador com firmeza, pressione a ponta para o tecido e gire o perfurador e para trás. Pressione o êmbolo para ejetar o disco soco em uma mistura de reação de PCR. Certifique-se de que a amostra cai para dentro da solução de PCR e não aderem às paredes do tubo. Limpe a ponta do perfurador entre cada amostra para evitar a contaminação cruzada, mergulhando-o em solução de hipoclorito de sódio a 2%. Pressione o êmbolo para cima e para baixo algumas vezes e limpe a ponta com uma toalha de papel. A placa de corte deve ser tambémenxaguado entre amostras. Em seguida, utilizam uma Thermo Scientific Piko 24 cavidades Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko Placa PCR para realizar as reacções de PCR, utilizando as condições de ciclagem descritas na Tabela 2. As reacções de PCR pode também ser realizada em convencionais de PCR termocicladores. Após a PCR, girar o material vegetal. Transferir 5 ul de sobrenadante para um tubo de microcentrífuga novo. Adicionar 4 ul de água e 1 ul da enzima de restrição, SspI. Misturar suavemente e girada para baixo rapidamente para recolher o conteúdo na parte inferior do tubo. Incubar a mistura de reacção durante uma hora a 37 ° C. Inactivar a enzima de restrição, por incubação a 65 ° C durante 20 min. Quando a amplificação do ADN directamente a partir de tecidos de plantas, os produtos de PCR de plantas e incluem PCR derivado de componentes que possam interferir com a enzima de digestão de restrição. Por isso, pode ser necessário diluir ou (por exemplo, 1:2 ou 1:3 em água), ou purificar o produto de PCR antes tele digestão subsequente, por exemplo, utilizando um kit comercial, tal como apropriado Thermo Scientific Purification Kit GeneJET PCR. Após a digestão com enzimas de restrição, análise dos fragmentos resultantes num gel de agarose. Adicionar 2,5 uL de tampão de carga de 5x à reacção e de electroforese em gel de agarose a realizar com 10 uL da mistura resultante. 2. Amplificar fragmentos específicos de DNA a partir de Carvalho de 15 anos de idade, Folhas usando o protocolo de diluição Para começar, corte um soco 2 mm de folha de carvalho. Colocar a amostra em 20 ul de tampão de diluição fornecido com a Usina direto Phire Kit PCR. Limpe a ponta do perfurador e corte tapete como antes. Triturar a amostra de folha com uma ponta de pipeta de 100 uL, pressionando-o contra brevemente a parede do tubo. Dependendo do material de planta, o protocolo de diluição, por vezes, trabalha melhor sem esmagamento da amostra. Girar as amostras brevemente numa microcentrífuga até tele reacções são no fundo dos tubos. O sobrenadante pode ser utilizado directamente na PCR, ou pode ser diluído 1:10 ou 1:100 em água estéril, dependendo do tipo de amostra. Utilizar 0,5 ul de 1 ul do sobrenadante ou diluição como molde para uma reacção de PCR 20 ul. Preparar a reacção, tal como descrito na Tabela 1. Uma vez que as reacções são preparados, empregar uma Thermo Scientific Piko 24 cavidades Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko Placa PCR para realizar as reacções de PCR, utilizando as condições de ciclagem descritas na Tabela 2. As reacções de PCR pode também ser realizada em convencionais de PCR termocicladores. Após a PCR, adicionam-se 5 ul de tampão de carregamento de 5x à reacção e de electroforese em gel de agarose a realizar com 15 uL da mistura resultante. 3. Genotipagem de camundongos transgênicos que utilizam o protocolo de diluição Iniciar o protocolo de diluição em ratinhos transgénicos, colocando um perfurador 2 mm da mouse orelha em 20 ul de tampão de diluição contendo 0,5 uL de Aditivo DNARelease fornecido com o Kit de tecido animal Phire PCR directo. Incubar as amostras à temperatura ambiente, durante 2 min, seguido de 2 minutos de incubação a 98 ° C. Girar as amostras brevemente numa microcentrífuga até que as reacções estão na parte inferior dos tubos. Use 1 ul de sobrenadante como molde para uma reacção de PCR 20 uL, preparado tal como descrito na Tabela 3. Qualquer sobrenadante que não está a ser utilizado pode ser imediatamente transferida para um novo tubo e armazenado a -20 ° C. Em seguida, utilizam uma Thermo Scientific Piko 24 cavidades Thermal Cycler e Thermo Scientific Piko Placa PCR para realizar as reacções de PCR, utilizando as condições de ciclagem descritas na Tabela 4. Mais uma vez, as reacções de PCR pode também ser realizada em termocicladores convencionais de PCR. Seguindo PCR, adicionam-se 5 ul de tampão de carregamento de 5x à reacção e de electroforese em gel de agarose a executar wul 15 i da mistura resultante. 4. Resultados representativos Na técnica dCAPS o sítio de restrição dentro do SNP de interesse é introduzida ou destruídos ou usando um iniciador de PCR, com uma ou mais diferenças para o DNA-alvo. A genotipagem de indivíduos de plantas de Arabidopsis foi realizada com a técnica dCAPS directamente a partir de punções de folha. Os produtos amplificados foram digeridos e os fragmentos resultantes revelando o genótipo de cada indivíduo foram analisados ​​por electroforese em gel (Figura 2). Neste exemplo, os 160 pb produtos de PCR contendo o local SNP de interesse (G ou alelo A), no genoma de Arabidopsis foram amplificados a partir de punções de folha da planta com a planta directa Phire Kit PCR. O iniciador directo continha uma incompatibilidade na extremidade 3 ', criando um local de restrição SspI-específica no ADN alvo, que inclui o SNP de interesse (alelo A), mas nãono outro alelo do SNP (Figura 2B). Protocolos de diluição é necessária para material de planta desafiador, tais como a folha de carvalho, devido à sua elevada concentração de compostos fenólicos. Usando o protocolo de diluição descrito aqui, o fragmento de 297 pb de DNA cloroplástico foi amplificado utilizando o protocolo de três passos. Amostras de folhas de carvalho com diferentes diluições são mostrados na Figura 3, para além dos controlos positivo e negativo. O animal Phire Tissue Kit de PCR directo foi empregado com um protocolo de desafio em que apenas um conjunto de iniciadores foi utilizado para a amplificação de dois fragmentos com uma diferença de tamanho grande, resultando em rendimentos abundantes de ambos os produtos correctamente tamanho de 1500 pb para ratos transgénicos e 200 pb para ratinhos de tipo selvagem (Figura 4). A banda mais fraca superior com camundongos heterozigotos é devido à concorrência de ambos os modelos (alelos) para o par de primers mesmo, porém, o genotyping resultados são inequívocos. A estabilidade das amostras preparadas utilizando o protocolo de diluição foi também testado. Os resultados mostram que as amostras de diluição podem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos um ano. Além disso, repetidos de congelamento / descongelamento não afectou significativamente a reacção (Figura 5). Também é mostrado a amplificação a partir de amostras de rato robusto orelha tecido com Phire polimerase de DNA e do método de PCR directa em comparação com hot start Taq polimerase e DNA purificada (Figura 6). Componentes Reacção de 20 uL 50 reação ul Conc final. H 2 O adicionar 20 ul adicionar a 50 ul 2x Phire Planta PCR buffer 10 ul 25 ul 1x Um iniciador X ul X ul 0,5 uM iniciador B X ul X ul 0,5 uM Phire Hot Start DNA Polimerase II 0,4 ul 1 ul Amostra / protocolo direto 0,50 milímetros perfurador Amostra / diluição protocolo 0,5-1 ul Tabela 1. Condições de reação para Usina de PCR utilizado neste protocolo. Passo ciclo Temp. Tempo Ciclos Desnaturação inicial 98 ° C 5 min 1 Desnaturação Recozimento * Extensão 98 ° C X ° C 72 ° C 5 seg 5 seg 20 sec 40 Extensão final 72 ° C 4 ° C 1 min segurar 1 Tabela 2. Condições do ciclismo para Usina de PCR utilizado neste protocolo. * A calculadora Tm emoscientific.com / pcrwebtools "target =" _blank "> www.thermoscientific.com / pcrwebtools é recomendado para a determinação da Tm para primers a serem usados ​​com ADN polimerase Hot Phire Iniciar II. A temperatura recomendada para recozimento primers ≤ 20 nt é igual a Tm mais baixa dado pela ferramenta web. Para iniciadores> 20 nt, utilizar uma temperatura de recozimento de 3 ° C mais elevada do que a Tm mais baixa dado pela ferramenta web. Componentes Reacção de 20 uL Conc final. H 2 O adicionar 20 ul 2x Phire tecido animal PCR buffer 10 ul 1x Um iniciador X ul 0,5 uM iniciador B X ul 0,5 uM Phire Hot Start DNA Polimerase II 0,4 ul Amostra / diluição protocolo 1 ul Tabela 3. Condições de reacção para tecidos animais PCR utilizada neste protocolo. Passo ciclo Temp. Tempo Ciclos Desnaturação inicial 98 ° C 5 min 1 Desnaturação Recozimento * Extensão 98 ° C X ° C 72 ° C 5 seg 5 seg 20 seg ≤ 1 kb 20 seg / kb> 1 kb 40 Extensão final 72 ° C 4 ° C 1 min Segurar 1 Tabela 4. Condições do ciclismo para tecidos animais PCR utilizados neste protocolo. * O calculador de Tm em www.thermoscientific.com / pcrwebtools é recomendado para a determinação da Tm para primers para ser usado com Phire Hot DNA Polymerase Iniciar II. A temperatura recomendada para recozimento primers ≤ 20 nt é igual ao Tm mais baixa dado pela ferramenta web. Para iniciadores> 20 nt, utilizar uma temperatura de recozimento de 3 ° C mais elevada do que a mais baixa Tm determinada pela ferramenta web. Figura 1. PCR directo do fluxo de trabalho. Directo de PCR pode ser realizada utilizando dois protocolos alternativos. No protocolo direto uma pequena quantidade de amostra é adicionado diretamente ao PCR reacção. O protocolo de diluição emprega um passo de pré-incubação breve, antes da PCR para libertar o DNA do material da amostra. Figura 2. A genotipagem de indivíduos de plantas de Arabidopsis com dCAPS técnica directamente a partir de punções de folha. A) A figura 2A mostra o princípio do ensaio dCAPS realizada. O sítio de restrição dentro do SNP de interesse é introduzido ou removido ou por PCR utilizando um iniciador com uma ou mais diferenças para o DNA-alvo. Os produtos de PCR são digeridos, e os fragmentos resultantes revelar o genótipo de cada indivíduo, quando analisado por electroforese. B) 0,50 milímetros punções de folhas das plantas foram colocadas directamente em 50 ul de reacções de PCR. Os 160 pb a produtos de PCR contendo o local SNP (G ou alelo A) foram amplificadas com iniciadores a introdução de um sítio único SspI para o alelo. Os produtos de PCR foram não purificados digestãoted com a enzima de restrição Sspl. Fragmentos resultantes foram analisados ​​num gel de agarose a 3%. Pista M é o marcador de tamanho; pistas A e G correspondem aos alelos do SNP de cada amostra. Os resultados obtidos foram confirmadas por análise convencional de extracção de ADN, seguido por PCR e digestão de restrição (dados não mostrados). As reacções de controlo negativo sem ADN molde foram incluídos no conjunto de ensaio, e corrido num gel de agarose separado em paralelo com as reacções de PCR actuais antes de realizar as digestões (dados não mostrados). Figura 3. Protocolo de diluição utilizando-se amostras de folhas de carvalho. O protocolo de diluição foi usado para amplificar o fragmento de 297 pb de DNA cloroplástico em amostras de folhas de carvalho (3-passo do protocolo, hibridação a 62 ° C) em diluições diferentes (1:100, 1:10, 1 : 1 e 2:1) e con positivo e negativotrols [C +: controlo positivo de DNA purificada (Arabidopsis), C-: controlo negativo sem ADN]. A nomenclatura amostra representa o local de coleta da amostra (cidades na Finlândia) e da amostra de numeração. Figura 4. A genotipagem de ratinhos transgénicos com um par de iniciadores, utilizando o protocolo de diluição. Tecidos da orelha dos nove ratinhos individuais (pistas 1-9) foram colocados em 20 ul de tampão de diluição incluindo Aditivo DNARelease. Após as incubações à temperatura ambiente e 98 ° C, 1 ml de sobrenadante foi utilizado como molde na reacção de PCR 20 ul. Tamanhos de fragmentos: 1500 bp (transgênicos) e 200 pb (tipo selvagem). Figura 5. As amostras preparadas de acordo com o protocolo de diluição são estáveis ​​durante o armazenamento a longo prazo. Amostras de tecidos da orelha de rato foram inc ubated em 20 ul de tampão de diluição incluindo Aditivo DNARelease e submetidos a congelamento repetido / descongelamento (pista 1), armazenado a -20 ° C durante um ano (pista 2), ou utilizada imediatamente para PCR (pista 3). Os tamanhos dos fragmentos amplificados foram de 900 pb, 1500 pb e 3200 pb. Figura 6. Phire tecido animal directa PCR Kit supera um sistema de purificação de ADN comercial combinado com um hot start Taq DNA polimerase. Quatro amplicons (0,5-1,5 kb) foram amplificados a partir de tecidos de rato da orelha utilizando o protocolo de diluição do Tissue Phire directa animal Kit PCR. Para efeitos de comparação, o ADN foi primeiro purificado utilizando um kit comercial de extracção de ADN e os mesmos fragmentos foram amplificados utilizando um hot start Taq ADN polimerase de acordo com as recomendações dos fabricantes. Apenas com o Animal Tissue Phire directa PCR Kit foram todos os quatro fragmentos amplificados com sucesso amplificados. t "> Figura 7. Universal comparação do fluxo de trabalho com a estimativa dos tempos / reagentes consumidos. Thermo Scientific directa abordagem de PCR é comparada com a abordagem de isolamento de ADN, a abordagem de tampão de extracção, e a abordagem de tampão PCR. O tempo previsto para cada abordagem, antes da etapa de PCR é listada em texto vermelho. A Thermo Scientific direto abordagem PCR leva apenas 0-4 minutos para a preparação da amostra antes da PCR. Abaixo de cada método, os reagentes consumidos são listados. A Thermo Scientific direto abordagem PCR usa a menor quantidade de reagentes em comparação com os outros métodos. Clique aqui para ver maior figura .