前のDNA精製せずに植物や動物のサンプルの遺伝子型

1。直接プロトコルを持つシロイヌナズナ植物個体のジェノタイピング シロイヌナズナ植物の葉の上に直接dCAPSジェノタイピングアッセイを開始するには、まず、 表1に示すようにPHIREプラントダイレクトPCRキットを用いて、20または50μlのPCR反応を定式化する。 次に、ハリスユニコアとハリス·カッティングマットを使用して、 シロイヌナズナ植物の葉から0.50 mmのパンチをカット。しっかりとパンチャーを持って、組織の中に最先端を押すと前後にパンチャーを回転させます。 PCR反応混合物にパンチ、ディスクを取り出すにプランジャを押してください。サンプルはPCR溶液に落下し、管壁に付着しないことを確認します。 2パーセント次亜塩素酸ナトリウム溶液中に浸漬して、クロスコンタミネーションを防止するために、各サンプル間のパンチャーの最先端を清掃してください。プランジ​​ャーを押して、上下に数回、清潔なペーパータオルで刃先を拭いてください。カッティングマットもあるべきサンプル間でリンスした。 次に、 表2に記載のサイクリング条件を用いてPCR反応を実行するためのサーモサイエンティフィックピコピコ24ウェルサーマルサイクラーとサーモサイエンティフィックピコピコPCRプレートを採用しています。 PCR反応は、従来のPCRサーマルサイクラーで行うことができます。 PCR後、植物材料をスピンダウンします。新しいマイクロチューブに上清5μlを移す。水4μlを、制限酵素、SSPIを1μl加え。穏やかに混合し、チューブの底に内容物を収集するために簡単にスピンダウンします。 37℃で1時間反応混合物をインキュベート℃に20分間65℃でインキュベートすることにより、制限酵素を不活性化する。 植物組織から直接DNAを増幅する場合、PCR産物を制限酵素消化酵素を妨げる可能性があり、植物やPCR由来成分が含まれています。したがって、それはどちらの希釈（ 例えば 1:2または水で1:3）またはtの前にPCR産物を精製する必要があるかもしれません彼はそのようなサーモサイエンティフィックGeneJET PCR精製キットのような適当な市販のキットを用いて、例えば、その後の消化。 制限酵素消化後、アガロースゲル電気泳動で得られた断片を分析します。反応液に5倍のローディングバッファー2.5μlを添加し、得られた混合物の10μlをアガロースゲル電気泳動を行う。 2。 15歳のオークから特異的なDNA断片を増幅するには、希釈プロトコルを使用して葉開始するには、オークの葉の2mmのパンチをカット。 PHIRE工場ダイレクトPCRキットに付属の希釈緩衝液20μlにサンプルを置きます。パンチャーの最先端をきれいにし、前のようにマットをカット。 管の壁に簡単にそれを押すことによって、100μlのピペットの先端で葉のサンプルをつぶす。植物材料に応じて、希釈プロトコルは、時々サンプルを破砕せずにうまく動作します。 tまで微量で簡単にサンプルをスピン彼の反応は、チューブの底にあります。 上清をPCRに直接使用することができ、またサンプルの種類に応じて、滅菌水で1:10または1:100に希釈することができる。 20μlのPCR反応の鋳型として清または希釈液の1μlに0.5μlを使用する。 表1に記載したように反応を準備します。 一度反応が用意されており、 表2に記載のサイクリング条件を用いてPCR反応を実行するためにサーモサイエンティフィックピコピコ24ウェルサーマルサイクラーとサーモサイエンティフィックピコピコPCRプレートを採用しています。 PCR反応は、従来のPCRサーマルサイクラーで行うことができます。 PCR後、反応液に5倍のローディングバッファーを5μlを加え、得られた混合物の15μlをアガロースゲル電気泳動を行う。 3。希釈プロトコルを使用してトランスジェニックマウスのジェノタイピング mの2 mmのパンチを配置することによって、トランスジェニックマウスで希釈プロトコルを開始PHIRE動物組織ダイレクトPCRキットに付属DNARelease添加剤の0.5μlを含む希釈バッファー20μlにウーズの耳。 98℃2分のインキュベーションに続いて2分、℃の室温でサンプルをインキュベートする反応はチューブの底になるまで遠心で簡単にサンプルをスピン。 表3に記載のように調製し、20μlのPCR反応の鋳型として清1μlを使用する。すぐに使用されるためにされていない任意の上清を新しいチューブに移し、-20℃で保存することができます次に、 表4に記載のサイクリング条件を用いてPCR反応を実行するためのサーモサイエンティフィックピコピコ24ウェルサーマルサイクラーとサーモサイエンティフィックピコピコPCRプレートを採用しています。繰り返しになりますが、PCR反応は、従来のPCRサーマルサイクラーで行うことができます。 PCR後、反応液に5倍のローディングバッファー5μlを追加し、アガロースゲル電気泳動ワットを行う得られた混合物のi番目の15μlの。 4。代表的な結果 dCAPS技術では目的のSNP内の制限部位はどちら標的DNAに1つまたはそれ以上のミスマッチを有するPCRプライマーを用いて導入するか、または破棄されます。 シロイヌナズナ植物個体の遺伝子型を直接葉のパンチからdCAPS技法を用いて行った。増幅産物を消化し ​​、各個体の遺伝子型を明らかに得られた断片をゲル電気泳動（ 図2）により分析した。 この例では、 シロイヌナズナゲノム中に目的のSNP部位（Gまたは対立遺伝子）を含む160bpのPCR産物がPHIRE工場ダイレクトPCRキットを用いた植物の葉のパンチから増幅した。フォワードプライマーは、目的のSNP（対立）ではなく、が含まれていた標的DNA中SspIで固有の制限部位を、作成、3 '末端に1つのミスマッチを含んでいたSNPの他の対立遺伝子（ 図2B）インチ希釈プロトコルは、フェノール性化合物のその高い濃度のためにそのようなオークの葉のような挑戦的な植物材料、のために必要である。ここで説明する希釈プロトコルを使用して、葉緑体DNAの297塩基対の断片は、3ステップのプロトコルを用いて増幅した。様々な希釈とオークの葉の標本は、正と負の制御に加えて、 図3に示されています。 PHIRE動物組織ダイレクトPCRキットは、トランスジェニックマウス、1,500 bpおよび200 bpのための正しいサイズの製品の両方の豊かな収率で得られた、唯一つのプライマーセットが大きいサイズの差を持つ2つのフラグメントの増幅のために使用した挑戦的なプロトコルで採用された野生型マウス（ 図4）。ヘテロ接合体マウスを用いた弱い上部のバンドは、同じプライマーペアの両方のテンプレート（対立遺伝子）の競争のためであるが、genotypる結果は明白です。 希釈プロトコルを使用して調製したサンプルの安定性もテストされています。結果は希釈サンプルは、少なくとも1年間は-20℃で保存することができることを示している。さらに、繰り返し凍結/融解サイクルが大幅に反応します （ 図5）には影響しなかった。また、ホットスタートTaqポリメラーゼおよび精製されたDNA（ 図6）に比べPHIRE DNAポリメラーゼおよびダイレクトPCR法を用いたマウス耳組織サンプルからの堅牢な増幅が示されている。 コンポーネント 20μlの反応 50μlの反応 最終濃度。 H 2 O 20μlに追加 5に追加0μlの 2倍PHIRE植物のPCRバッファー 10μlの 25μlの 1X プライマー μlのX μlのX 0.5μMでプライマーB μlのX μlのX 0.5μMで PHIREホットスタートII DNAポリメラーゼ 0.4μL 1μlのサンプル/ダイレクトプロトコル 0.50ミリメートルパンチサンプル/希釈プロトコル 0.5から1μL 表1。植物のPCRの反応条件は、このプロトコルで使用される。 サイクルステップ Tempです。 時間 サイクル 初期変性 98℃ 5分 1 変性 *をアニーリング延長 98℃ X℃で 72℃ 5秒 5秒 20秒 40 最後の伸長 72℃ 4℃ 1分ホールド 1 表2植物のPCR用のサイクリング条件は、このプロトコルで使用される。 * Tmは電卓でoscientific.com / pcrwebtools "ターゲット=" PHIREホットスタートII DNAポリメラーゼで使用するプライマーのTmを決定する際には、_blank "> www.thermoscientific.com / pcrwebtoolsが推奨されます。プライマーの推奨アニール温度が≤20 NTに等しいWebツールによって与えられる低いTmはプライマー> 20 NTの場合は、アニーリング温度を使用して3°Webツールによって与えられる低いTmよりC高い。 コンポーネント 20μlの反応 最終濃度。 H 2 O 20μlに追加 2倍PHIRE動物組織PCRバッファー 10μlの 1X プライマー μlのX 0.5μMでプライマーB μlのX 0.5μMでペーハー怒りホットスタートII DNAポリメラーゼ 0.4μL サンプル/希釈プロトコル 1μlの 表3動物の組織PCRの反応条件は、このプロトコルで使用される。 サイクルステップ Tempです。 時間 サイクル 初期変性 98℃ 5分 1 変性 *をアニーリング延長 98℃ X℃で 72℃ 5秒 5秒 20秒≤1キロバイト 20秒/ KB> 1キロバイト 40 最後の伸長72℃ 4℃ 1分ホールド 1 表4は、このプロトコルで使用される動物の組織PCRのサイクル条件。 で* Tmは電卓www.thermoscientific.com / pcrwebtoolsは PHIREホットスタートDNAポリメラーゼIIで使用するプライマーのTmを決定する際に推奨されます。プライマー≤20 ntのための推奨アニーリング温度はWebツールによって与えられる低いTmに等しい。プライマー> 20 NTの場合は、下のTmよりも℃高いWebツールによって与えアニール温度3を使用します。 図1。ダイレクトPCRワークフロー。ダイレクトPCRは2代替のプロトコルを使用して実行できます。直接のプロトコルでは、試料の少量をPCに直接追加されますRの反応。希釈プロトコルは、試料物質からDNAを放出するためのPCRの前に簡単なプレインキュベーション工程を採用しています。 図2。直接リーフパンチからdCAPS技術とシロイヌナズナ植物個体の遺伝子型別。 A）は、図2Aは、実行dCAPSアッセイの原理を示す。目的のSNP内の制限部位はどちら導入または標的DNAへの1つまたはそれ以上のミスマッチを持つプライマーを用いたPCRによって除去される。 PCR産物を消化し ​​、電気泳動で分析したときに得られた断片は、それぞれの個体の遺伝子型を明らかにする。B）は 、植物の葉から0.50 mmのパンチは50μlのPCR反応に直接置かれている。 SNP部位（Gまたは対立遺伝子）を含む160bpのPCR産物がアレルにユニークなSSPIの部位を導入するプライマーを用いて増幅した。未精製のPCR産物はdigesだったSSPIの制限酵素でテッド。得られた断片を3％アガロースゲル上で分析した。レーンMはサイズマーカーで、レーンがあり、G各サンプルのSNP対立遺伝子に対応しています。得られた結果は、PCRや制限酵素処理（データは示していない）が続いてDNA抽出の従来の分析によって確認した。テンプレートDNAなしのネガティブコントロール反応を消化した（データは示していない）を実行する前に、テストの設定と実際のPCR反応と並行して別々のアガロースゲル上で実行に含まれていた。 図3。希釈プロトコルはオークの葉のサンプルを使用した。希釈プロトコルが（1:100、1:10、1異なる希釈でオークの葉のサンプル（3ステップのプロトコル、62℃でアニール）の葉緑体DNAの297塩基対の断片を増幅するために使用されました：1と2:1）と、正と負の詐欺trols [C + +：C：いいえ、鋳型DNAとネガティブコントロール精製DNA（ シロイヌナズナ ）からポジティブコントロール]。サンプルの命名法は、試料捕集サイト（フィンランドの町）と番号のサンプルを表しています。 図4。希釈プロトコルを使用して1つのプライマー対を持つトランスジェニックマウスの遺伝子型別。9個々のマウス（レーン1-9）の耳の組織はDNARelease添加剤を含む希釈緩衝液20μlに入れた。室温および98℃でインキュベーションした後、上清1μlを20μlのPCR反応の鋳型として用いた。フラグメントサイズ：1500 BP（トランスジェニック）および200bp（野生型）。 図5。サンプルは、希釈プロトコルに従って調製長期保存のために安定している。マウス耳組織のサンプルはincあっ DNARelease添加剤を含む希釈バッファー20μlにubated、繰り返し凍結/解凍（レーン1）にかけ、1年間（レーン2）、​​-20℃で保存し、またはPCR（レーン3）のために直ちに使用。増幅断片のサイズは900bpの、1500 bpと3200 bpであった。 図6。 PHIRE動物組織ダイレクトPCR KitはホットスタートTaq DNAポリメラーゼと結合し、市販のDNA精製システムよりも優れています。四リコン（0.5-1.5 KBは）PHIRE動物組織ダイレクトPCRキットの希釈プロトコルを使用して、マウスの耳組織から増幅した。比較のために、DNAは最初、市販のDNA抽出キットを用いて、同一のフラグメントは、製造業者の推奨に従ってホットスタートTaq DNAポリメラーゼを用いて増幅した精製した。のみPHIRE動物組織ダイレクトPCRキットで正常に増幅4つのすべてのアンプリコンがあった。 トン "> 図7。回/消費試薬の推定を伴うワークフローのユニバーサル比較。サーモサイエンティフィックダイレクトPCR法は、DNA単離アプローチ、抽出バッファーのアプローチ、およびPCRバッファアプローチと比較されます。 PCRの前工程へのそれぞれのアプローチのための推定時間が赤文字で表示されています。サーモサイエンティフィックダイレクトPCR法は、PCRの前に試料調製のための唯一の0から4分かかります。各メソッドの下に、消費された試薬が記載されています。サーモサイエンティフィックダイレクトPCR法は他の方法と比較して試薬の最小量を使用しています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。