التنميط الجيني للعينات النباتية والحيوانية دون تنقية DNA قبل

1. التنميط الجيني للأفراد نبتة Arabidopsis مع بروتوكول المباشرة لبدء الفحص التنميط الجيني dCAPS مباشرة على أوراق النبات arabidopsis، ووضع أول 20 أو 50 ميكرولتر ردود الفعل PCR باستخدام النباتات Phire المباشر PCR كيت كما هو موضح في الجدول 1. المقبل، وقطع لكمة مم 0،50 من أوراق نبتة Arabidopsis باستخدام هاريس أحادي النواة وهاريس بساط القطع. عقد الناخس بحزم، اضغط على حافة القطع في الأنسجة وتدوير الناخس ذهابا وإيابا. اضغط على المكبس إلى إخراج القرص لكمة إلى خليط التفاعل PCR. تأكد من أن عينة انخفاض في حل PCR ولا التمسك جدران الأنبوب. تنظيف حافة القطع من الناخس بين كل عينة لمنع انتقال التلوث عن طريق غمس هو داخل حل NaClO 2٪. اضغط على المكبس صعودا وهبوطا عدة مرات ومسح حافة القطع مع منشفة ورقية نظيفة. ينبغي أن يكون أيضا قطع حصيرةتشطف بين العينات. المقبل، توظيف العلم الحرارية Piko 24 Cycler جيدا الحرارية والحرارية العلمية لوحة PCR Piko لأداء تفاعلات PCR باستخدام الدراجات الشروط المبينة في الجدول رقم 2. ويمكن أيضا ردود الفعل PCR أن يؤديها في cyclers التقليدية الحرارية PCR. بعد PCR، وتدور باستمرار على المواد النباتية. نقل 5 ميكرولتر من طاف لأنبوب microcentrifuge جديد. إضافة 4 ميكرولتر من الماء و 1 ميكرولتر من تقييد انزيم، SSPI. المزيج بلطف وتدور لفترة وجيزة لأسفل لجمع محتويات في الجزء السفلي من الأنبوب. احتضان خليط التفاعل لمدة ساعة في 37 ° C. تعطيل انزيم التقييد في احتضان C ° 65 لل20 دقيقة. عندما تضخيم الحمض النووي مباشرة من الأنسجة النباتية، والمنتجات النباتية وتشمل PCR PCR-مشتقة المكونات التي قد تتداخل مع تقييد انزيم الهضم. لذلك، قد يكون من الضروري لتخفيف إما (مثل 1:2 أو 1:3 في الماء) أو تنقية المنتج PCR قبل رانه الهضم لاحقة، على سبيل المثال عن طريق استخدام مجموعة مناسبة التجارية مثل كيت الحرارية GeneJET العلمية تنقية PCR. بعد الهضم انزيم التقييد، وتحليل الشظايا الناجمة على هلام الاغاروز. إضافة 2.5 ميكرولتر من العازلة تحميل 5X إلى رد فعل وأداء الاغاروز الكهربائي للهلام مع 10 ميكرولتر من خليط الناتجة عن ذلك. 2. تضخيم أجزاء محددة من الحمض النووي اوك 15-عاما يغادر باستخدام بروتوكول التخفيف لبدء، وقطع لكمة 2 مم ورقة البلوط. وضع العينة في 20 ميكرولتر من العازلة التخفيف المرفق مع عدة النبات Phire PCR المباشر. تنظيف حافة القطع من الناخس وقطع حصيرة كما كان من قبل. سحق أوراق العينة مع طرف ماصة ميكرولتر 100 عن طريق الضغط عليه لفترة وجيزة ضد الجدار أنبوب. اعتمادا على المواد النباتية، وبروتوكول التخفيف يعمل في بعض الأحيان أفضل ألا يؤثر ذلك على العينة. تدور العينات لفترة وجيزة في ميكروسنتريفوج حتى رانه ردود الفعل في الجزء السفلي من الأنابيب. ويمكن استخدام طاف مباشرة في PCR، أو يمكن تخفيفه أو 1:100 1:10 في الماء المعقم وفقا لنوع العينة. استخدام 0،5 ميكرولتر إلى 1 ميكرولتر من طاف أو التخفيف كنموذج لتفاعل PCR ميكرولتر 20. إعداد رد الفعل كما هو موضح في الجدول 1. مرة واحدة يتم إعداد ردود الفعل، توظيف العلمية الحرارية Piko 24 Cycler جيدا الحرارية والحرارية العلمية لوحة PCR Piko لأداء تفاعلات PCR باستخدام الدراجات الشروط المبينة في الجدول رقم 2. ويمكن أيضا ردود الفعل PCR أن يؤديها في cyclers التقليدية الحرارية PCR. بعد PCR، إضافة 5 ميكرولتر من العازلة تحميل 5X إلى رد فعل وأداء الاغاروز الكهربائي للهلام مع 15 ميكرولتر من خليط الناتجة عن ذلك. 3. التنميط الجيني من الفئران المعدلة وراثيا باستخدام بروتوكول التخفيف بدء بروتوكول التخفيف على الفئران المعدلة وراثيا عن طريق وضع لكمة 2 مم من م[أوس] الأذن في 20 ميكرولتر من العازلة التخفيف المحتوي على 0.5 ميكرولتر من DNARelease المضافة المتوفرة مع الأنسجة الحيوانية Phire كيت PCR المباشر. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة، تليها الحضانة عند 98 دقيقة 2 ° C. تدور العينات لفترة وجيزة في ميكروسنتريفوج حتى ردود الفعل في الجزء السفلي من الأنابيب. استخدم 1 ميكرولتر من طاف كقالب للتفاعل PCR ميكرولتر 20، أعدت كما هو موضح في الجدول رقم 3. يمكن نقل أي طاف لا لاستخدامها على الفور لأنبوب جديد وتخزينها في -20 درجة مئوية. المقبل، توظيف العلم الحرارية Piko 24 Cycler جيدا الحرارية والحرارية العلمية لوحة PCR Piko لأداء تفاعلات PCR باستخدام الدراجات الشروط المبينة في الجدول رقم 4. مرة أخرى، يمكن أيضا أن ردود الفعل PCR أن يؤديها في cyclers PCR التقليدية. بعد PCR، إضافة 5 ميكرولتر من العازلة تحميل 5X إلى رد فعل وأداء الاغاروز هلام الكهربائي ثإيث 15 ميكرولتر من خليط الناتجة عن ذلك. 4. ممثل النتائج في هذه التقنية هو عرض dCAPS إما تقييد موقع داخل SNP في المصالح أو دمرت باستخدام PCR التمهيدي مع واحد أو أكثر إلى عدم التطابق DNA الهدف. تم إجراء التنميط الجيني للأفراد نبتة Arabidopsis مع تقنية dCAPS مباشرة من اللكمات ورقة. تم هضمها المنتجات تضخيمها وتم تحليل الشظايا الناجمة الكشف عن التركيب الوراثي لكل فرد من هلام الكهربائي (الشكل 2). في هذا المثال، تم تضخيم ال 160 BP المنتجات PCR يحتوي على موقع SNP من الفائدة (G أو أليل A) في الجينوم ل arabidopsis من اللكمات أوراق النبات مع مجموعة النباتات Phire PCR المباشر. الواردة التمهيدي واحدة إلى الأمام عدم تطابق في نهاية 3 '، إنشاء موقع تقييد SSPI محددة في DNA الهدف، والتي تضمنت تهم SNP (A أليل) ولكن ليسفي أليل أخرى من SNP (الشكل 2B). البروتوكولات اللازمة لتخفيف المواد النباتية صعبة، مثل ورقة البلوط، وذلك بسبب تركيز عال من المركبات الفينولية. وباستخدام بروتوكول التخفيف الموصوفة هنا، تضخيم جزء BP 297 من البلاستيدات الخضراء DNA باستخدام بروتوكول 3-الخطوة. وتظهر عينات نبات البلوط مع التخفيفات مختلفة في الشكل 3، بالإضافة إلى الضوابط الإيجابية والسلبية. كان يعمل في الأنسجة الحيوانية Phire المباشر PCR كيت مع بروتوكول صعبة حيث تم استخدام مجموعة واحدة فقط التمهيدي لتضخيم اثنين من شظايا مع اختلاف الحجم الكبير، مما أدى إلى غلة وفيرة من كل من المنتجات الحجم بشكل صحيح من 1،500 شركة بريتيش بتروليوم للالفئران المعدلة وراثيا وBP 200 ل الفئران البرية نوع (الشكل 4). الأضعف الشريط العلوي مع الفئران متغايرة ويرجع ذلك إلى المنافسة من كل من القوالب (الأليلات) للزوج نفسه التمهيدي، إلا أن genotypالنتائج جي هي لا لبس فيها. كما تم اختبار استقرار عينات أعدت باستخدام بروتوكول التخفيف. وأظهرت النتائج التي يمكن تخزينها على عينات التخفيف في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن سنة. وعلاوة على ذلك، لم تتكرر تجميد / الذوبان دورات لا تؤثر تأثيرا كبيرا على رد الفعل (الشكل 5). أظهرت أيضا هو التضخيم قوية من عينات الأنسجة الماوس الأذن باستخدام البلمرة DNA Phire وطريقة PCR المباشر مقارنة الساخن بداية طق بوليميريز وتنقية DNA (الشكل 6). مكونات 20 ميكرولتر رد فعل 50 ميكرولتر رد فعل اضرب النهائي. H 2 O إضافة إلى 20 ميكرولتر إضافة إلى 50 ميكرولتر 2X Phire النبات PCR العازلة 10 ميكرولتر سعة 25 ميكرولتر 1X A التمهيدي ميكرولتر X ميكرولتر X 0.5 ميكرومتر B التمهيدي ميكرولتر X ميكرولتر X 0.5 ميكرومتر Phire الساخن DNA II البداية البلمرة 0،4 ميكروليتر 1 ميكرولتر عينة / بروتوكول مباشرة 0.50 ملم لكمة عينة / التخفيف بروتوكول 0،5-1 ميكرولتر الجدول 1. تستخدم لظروف التفاعل PCR النباتية في هذا البروتوكول. دورة الخطوة TEMP. مرة دورات الأولي تمسخ 98 ° C 5 دقائق 1 يبدل طبيعة * الصلب تمديد 98 ° C X ° C 72 ° C 5 ثانية 5 ثانية 20 ثانية 40 ملحق النهائي 72 ° C 4 ° C 1 دقيقة عقد 1 الجدول 2. استخدام الدراجات لظروف PCR النباتية في هذا البروتوكول. * آلة حاسبة تيم فيoscientific.com / pcrwebtools "الهدف =" _blank "ويوصى> www.thermoscientific.com / pcrwebtools عند تحديد تيم للالاشعال لاستخدامه مع البلمرة DNA Phire بداية ساخنة II. درجة الحرارة الموصى بها للالاشعال الصلب ≤ 20 NT يساوي الدنيا التي قدمها تيم webtool. ل NT الاشعال> 20، استخدم درجة حرارة الصلب 3 ° C أعلى من أقل تيم التي قدمها webtool. مكونات 20 ميكرولتر رد فعل اضرب النهائي. H 2 O إضافة إلى 20 ميكرولتر 2X الأنسجة الحيوانية Phire PCR العازلة 10 ميكرولتر 1X A التمهيدي ميكرولتر X 0.5 ميكرومتر B التمهيدي ميكرولتر X 0.5 ميكرومتر فتاهغضب ساخن DNA II البداية البلمرة 0،4 ميكروليتر عينة / التخفيف بروتوكول 1 ميكرولتر الجدول 3. تستخدم لظروف التفاعل الحيوانية الأنسجة PCR في هذا البروتوكول. دورة الخطوة TEMP. مرة دورات الأولي تمسخ 98 ° C 5 دقائق 1 يبدل طبيعة * الصلب تمديد 98 ° C X ° C 72 ° C 5 ثانية 5 ثانية 20 ثانية ≤ 1 كيلو بايت 20 ثانية / ك> 1 كيلو بايت 40 ملحق النهائي 72 ° C 4 ° C 1 دقيقة عقد 1 الجدول 4. ظروف ركوب الدراجات الحيوانية الأنسجة PCR المستخدمة في هذا البروتوكول. * آلة حاسبة تيم في www.thermoscientific.com / pcrwebtools ينصح عند تحديد تيم للالاشعال لاستخدامه مع البلمرة DNA Phire بداية ساخنة II. درجة الحرارة الموصى بها للالاشعال الصلب ≤ 20 NT يساوي أقل تيم التي قدمها webtool. لNT الاشعال> 20، استخدم درجة حرارة الصلب 3 ° C أعلى من أقل تيم التي قدمها webtool. الشكل 1. لا يمكن أن يؤديها مباشرة PCR سير العمل. مباشرة باستخدام PCR بروتوكولين البديلة. في البروتوكول مباشرة يتم إضافة كمية ضئيلة من العينة مباشرة إلى PCR التفاعل. بروتوكول يستخدم تخفيف وجيزة قبل الحضانة الخطوة قبل PCR للافراج عن الحمض النووي من مادة العينة. الشكل 2. التنميط الجيني للأفراد نبتة Arabidopsis مع تقنية dCAPS مباشرة من اللكمات ورقة. A) ويبين الشكل 2A مبدأ الفحص dCAPS تنفيذها. هو عرض إما تقييد موقع داخل SNP في المصالح أو إزالتها عن طريق PCR باستخدام التمهيدي مع واحد أو أكثر إلى عدم التطابق DNA الهدف. يتم هضمها المنتجات PCR والشظايا الناجمة الكشف عن التركيب الوراثي لكل فرد عند تحليلها من قبل الكهربائي. B) وضعت اللكمات مم 0،50 من أوراق النبات مباشرة في 50 ميكرولتر ردود الفعل PCR. وتضخمت ال 160 BP المنتجات PCR يحتوي على موقع SNP (G أو أليل A) مع الاشعال إدخال موقع SSPI فريدة من نوعها لأليل-A. كانت المنتجات غير منقى PCR digesتيد مع انزيم تقييد SSPI. وقد تم تحليل الشظايا الناجمة عن مادة هلامية الاغاروز 3٪. حارة M هي علامة الحجم؛ الممرات وG A تتوافق مع الأليلات SNP من كل عينة. تم تأكيد النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل الحمض النووي لاستخراج التقليدية تليها PCR والهضم تقييد (لا تظهر البيانات). وشملت ردود الفعل السلبية من دون السيطرة DNA القالب في اختبار انشاء وتشغيل على هلام الاغاروز منفصلة بالتوازي مع ردود الفعل PCR الفعلية قبل تنفيذ الهضم (المعطيات غير معروضة). الشكل 3. بروتوكول التخفيف باستخدام عينات أوراق البلوط. تم استخدام بروتوكول تخفيف لتضخيم جزء BP 297 من البلاستيدات الخضراء في عينات DNA أوراق البلوط (3-الخطوة البروتوكول، في الصلب C ° 62) في التخفيفات مختلفة (1:100، 1:10، 1 : 1 و 2:1) ويخدع الإيجابية والسلبيةمفاتيح التحكم [C +: مراقبة إيجابية من DNA المطهرون (ل arabidopsis)، C-: المراقبة السلبية مع عدم وجود قالب DNA]. التسميات عينة تمثل موقع جمع العينات (المدن في فنلندا) وعينة الترقيم. الشكل 4. وضعت التنميط الجيني من الفئران المعدلة وراثيا مع الزوج التمهيدي واحد باستخدام بروتوكول التخفيف. الأنسجة الأذن من تسعة الفئران الفردية (الممرات 1-9) في 20 ميكرولتر من العازلة بما في ذلك التخفيف المضافة DNARelease. بعد حضانات في درجة حرارة الغرفة و 98 درجة مئوية، وقد استخدم 1 ميكرولتر من طاف كقالب في رد فعل 20 ميكرولتر PCR. أحجام جزء: 1،500 بي بي (المعدلة وراثيا) و 200 BP (wildtype). الشكل 5. إعداد العينات وفقا لبروتوكول التخفيف مستقرة للتخزين على المدى الطويل. عينات من أنسجة الأذن الماوس والمؤتمر الوطني العراقي ubated في 20 ميكرولتر من العازلة بما في ذلك التخفيف المضافة DNARelease وتعرض للتجميد المتكررة / ذوبان (حارة 1)، المخزنة في -20 ° C لمدة عام (حارة 2)، أو استخدامها على الفور لPCR (حارة 3). وكانت أحجام جزء تضخيم 900 شركة بريتيش بتروليوم، BP BP 1،500 و 3،200. الشكل 6. Phire الحيوانية الأنسجة مباشرة PCR كيت يتفوق على تنقية DNA التجارية جنبا إلى جنب مع نظام البلمرة DNA بداية ساخنة طق. وتضخمت أربع amplicons (0،5-1،5 KB) من أنسجة الأذن الماوس باستخدام بروتوكول التخفيف من كيت Phire الأنسجة الحيوانية PCR المباشر. على سبيل المقارنة، كان تنقية DNA 1 باستخدام استخراج DNA التجارية وعدة شظايا وتضخمت نفسه باستخدام ساخنة DNA بوليميراز بداية طق وفقا لتوصيات الصانعين. فقط مع أنسجة الحيوانات Phire كيت PCR المباشرة كانت كلها amplicons 4 تضخيم بنجاح. ر "> الشكل 7. مقارنة العالمي لسير العمل مع تقدير مرات / الكواشف المستهلكة. تتم مقارنة الحرارية العلمية نهج PCR DNA مباشرة إلى نهج العزلة، والنهج العازلة استخراج، والنهج العازلة PCR. يتم سرد الوقت المقدر لكل نهج الخطوة قبل PCR في النص الأحمر. النهج العلمي الحرارية PCR المباشر يستغرق سوى 0-4 دقائق لإعداد العينات قبل PCR. كل أسلوب أدناه، يتم سرد الكواشف المستهلكة. النهج العلمي الحرارية المباشرة PCR يستخدم أقل قدر من الكواشف بالمقارنة مع الطرق الأخرى. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .