Genotyping של דוגמאות צמחים ובעלי חיים, ללא טיהור DNA לפני

1. Genotyping של אנשי צמח ארבידופסיס עם פרוטוקול ישיר כדי להתחיל את assay genotyping dCAPS ישירות על עלי הצמח ארבידופסיס, לגבש 1 20 או 50 תגובות PCR μl באמצעות Phire צמח הישיר PCR הקיט כפי שמתואר בטבלה 1. בשלב הבא, לחתוך אגרוף 0.50 מ"מ מעלי צמח ארבידופסיס באמצעות אריס Uni-Core ומאט חיתוך האריס. מחזיק אגרופן בחוזקה, לחץ את חוד החנית לרקמה ולסובב את האגרופן קדימה ואחורה. לחץ על הבוכנה כדי להוציא את דיסק האגרוף לתוך תערובת תגובת PCR. ודא כי מדגם טיפין לתוך פתרון PCR ולא להיצמד לקירות הצינור. נקה את חוד החנית של האגרופן בין כל דגימה למניעת זיהום צולב על ידי טבילתו לפתרון 2% NaClO. לחץ על הבוכנה מעלה ומטה מספר פעמים ולנגב את חוד החנית במגבת נייר נקיה. מחצלת החיתוך צריכה להיות גםשטף בין דגימות. בשלב הבא, תעסיק Thermo Scientific Piko 24 גם תרמית Cycler וצלחת PCR Piko המדעי תרם לביצוע תגובות PCR באמצעות תנאי הרכיבה המתוארים בטבלה 2. את תגובות PCR יכולות גם להתבצע בcyclers התרמי PCR הקונבנציונלי. לאחר PCR, ספין למטה חומר צמחי. העברת 5 μl של supernatant לצינור microcentrifuge חדש. הוסף 4 μl מים וμl 1 מתוך אנזים הגבלה, SSPI. מערבב בעדינות והספין למטה בקצרה לאסוף תוכן בתחתית של תחתית. דגירת תגובת התערובת לשעה אחת ב 37 ° C. לנטרל את אנזים ההגבלה על ידי דוגר על 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. כשהגברת DNA ישירות מרקמות צמח, את מוצרי ה-PCR כוללים צמחים וPCR-derived רכיבים שעשויים להפריע לאנזים עיכול ההגבלה. לכן, ייתכן שיהיה צורך גם לדלל (למשל 1:2 או 1:03 במים) או לטהר את מוצר PCR לפני tהוא עוקב עיכול, למשל על ידי שימוש בערכה מסחרית מתאימה כגון ערכת Thermo Scientific GeneJET PCR טיהור. בעקבות עיכול אנזים הגבלה, לנתח את שהברים הנובעים על ג'ל agarose. הוסף 2.5 μl של חיץ הטעינה 5x לתגובה ולבצע אלקטרופורזה ג'ל agarose עם 10 μl מהתערובת שנוצרה. 2. הגברת קטעי DNA ספציפיים מאלון 15-בן עלים באמצעות פרוטוקול הדילול כדי להתחיל, לחתוך אגרוף 2 מ"מ של עץ אלון. הנח את הדוגמא ל20 μl של מאגר הדילול מסופק עם קיט PCR הצמח הישיר Phire. נקה את חוד החנית של האגרופן וחיתוך מחצלת כמו קודם. לרסק את המדגם עלה עם קצה פיפטה 100 μl ידי לחיצה אותו בחטף בקיר הצינור. בהתאם לחומר צמחי, פרוטוקול הדילול לפעמים עובד טוב יותר, מבלי למחוץ את המדגם. ספין הדגימות בקצרה בmicrocentrifuge עד tהוא תגובות הן בחלקו התחתון של צינורות. Supernatant ניתן להשתמש ישירות בPCR, או שזה יכול להיות מדולל 1:10 או 1:100 במים סטריליים, תלוי בסוג המדגם. השתמש 0.5 μl μl ל1 מתוך supernatant או דילול כתבנית לתגובת PCR 20 μl. הכן את התגובה כפי שמתואר בטבלת 1. ברגע שהתגובות שלהם מוכנות, להעסיק Thermo Scientific Piko 24 גם תרמית Cycler וצלחת PCR Piko המדעי תרם לביצוע תגובות PCR באמצעות תנאי הרכיבה המתוארים בטבלה 2. את תגובות PCR יכולות גם להתבצע בcyclers התרמי PCR הקונבנציונלי. לאחר PCR, להוסיף 5 μl של חיץ הטעינה 5x לתגובה ולבצע אלקטרופורזה ג'ל agarose עם 15 μl מהתערובת שנוצרה. 3. Genotyping של עכברים הטרנסגניים באמצעות פרוטוקול הדילול בגין פרוטוקול הדילול בעכברים הטרנסגניים ידי הצבת אגרוף של 2 מ"מ מ 'אוזן ouse ב20 μl של מאגר המכיל 0.5 μl דילול של תוסף DNARelease מסופק עם ערכת Phire בעלי חי הרקמות הישירות PCR. דגירת דגימות בטמפרטורת חדר במשך 2 דקות, ואחריו דגירת 2 דקות על 98 ° C. ספין הדגימות בקצרה בmicrocentrifuge עד שהתגובות הן בחלק התחתון של צינורות. השתמש μl 1 מתוך supernatant כתבנית לתגובת PCR 20 μl, שהוכנה כמתואר בטבלה 3. כל supernatant שאינו לשימוש מייד ניתן להעביר צינור חדש ומאוחסן ב -20 ° C. בשלב בא, תעסיק Thermo Scientific Piko 24 גם תרמית Cycler וצלחת PCR Piko המדעי תרם לביצוע תגובות PCR באמצעות תנאי הרכיבה המתוארים בטבלה 4. שוב, תגובות PCR יכולות גם להתבצע בcyclers PCR הקונבנציונלי. בעקבות PCR, להוסיף 5 μl של חיץ הטעינה 5x לתגובה ולבצע agarose ג'ל אלקטרופורזה w15 μl ith של תערובת שנוצרה. 4. נציג תוצאות בטכניקת dCAPS אתר ההגבלה בתוך SNP של עניין הוא הציג או נהרס באמצעות פריימר PCR עם חוסר התאמה אחת או יותר לדנ"א היעד. Genotyping של יחידים צמחים ארבידופסיס בוצע בטכניקת dCAPS ישירות מאגרופי עלים. המוצרים המוגברים היו מתעכלים ושהברים הנובעים חושפים הגנוטיפ של כל פרט נותחו על ידי אלקטרופורזה ג'ל (איור 2). בדוגמה זו, את 160 מוצרי BP PCR המכילים אתר SNP של עניין (G או אלל) בגנום ארבידופסיס היו מוגברים מאגרופי עלי צמח עם קיט PCR הצמח הישיר Phire. פריימר קדימה הכיל אי התאמה אחת בסופו של הדבר 3 ', יצירת אתר SSPI ספציפי הגבלה בDNA היעד, שכלל SNP של עניין (אלל) אך לאבאלל השני של SNP (איור 2 ב '). פרוטוקולי דילול הם הכרחיים לחומרים מאתגרים צמח, כגון עלה של עץ האלון, בשל הריכוז הגבוה של תרכובות פנוליות. באמצעות פרוטוקול הדילול מתואר כאן, שבר 297 נ"ב של DNA chloroplastic הוגבר באמצעות הפרוטוקול 3-הצעד. דגימות עלים מעץ אלון עם דילולים שונים מוצגות באיור 3, בנוסף לבקרות חיוביות ושליליות. ערכת Phire בעלי חי הרקמות הישירות PCR הועסקה בפרוטוקול מאתגר שבו רק סט אחד פריימר שמש להגברה של שני שברים עם הבדל בגודל גדול, וכתוצאה מכך תשואות שפע של שני המוצרים בגודל הנכון של 1500 נ"ב לעכברים הטרנסגניים ו200 BP ל עכברי סוג ברים (איור 4). הרצועה העליונה החלשה יותר עם עכברי heterozygote בשל התחרות של שתי התבניות (אללים) לאותו הזוג פריימר, אולם genotypהתוצאות הן חד משמעיות ing. היציבות של הדגימות שהוכנו באמצעות פרוטוקול הדילול נבדקה גם. התוצאות מראות כי דגימות הדילול ניתן לאחסן ב -20 ° C לשנה אחת לפחות. יתר על כן, מחזורים חוזרים ונשנים הקפאה / פשרה לא השפיעו משמעותי על התגובה (איור 5). מוצגת גם היא ההגברה החזקה מדגימות רקמת אוזן עכבר באמצעות DNA פולימראז Phire והשיטה הישירה PCR השוואה לפולימראז החם תחילת Taq וDNA מטוהר (איור 6). רכיבים 20 תגובת μl 50 תגובת μl Conc הסופי. H 2 O להוסיף עד 20 μl להוסיף עד 50 μl 2x Phire צמח PCR המאגר 10 μl 25 μl 1x פריימר X μl X μl 0.5 מיקרומטר B פריימר X μl X μl 0.5 מיקרומטר פולימראז Phire החם התחל השני דנ"א 0.4 μl μl 1 מדגם / פרוטוקול ישיר 0.50 מ"מ אגרוף מדגם / דילול פרוטוקול 0.5-1 μl טבלת 1. תנאי תגובה למפעל PCR בשימוש בפרוטוקול זה. שלב מחזור טמפ. זמן מחזורים denaturation הראשוני 98 מעלות צלזיוס 5 דקות 1 Denaturing חישול * הארכה 98 מעלות צלזיוס X ° C 72 ° C 5 שניות 5 שניות 20 שניות 40 הארכה סופית 72 ° C 4 מעלות צלזיוס 1 דקות להחזיק 1 טבלה 2. תנאי רכיבה על אופניים לתחנת PCR שימוש בפרוטוקול זה. * מחשבון Tm בoscientific.com / pcrwebtools "target =" _blank "> www.thermoscientific.com / pcrwebtools מומלץ בעת קביעת Tm לפריימרים לשימוש עם פולימראז Phire החם התחל השני דנ"א. טמפרטורת החישול המומלץ לפריימרים ≤ 20 nt שווה Tm הנמוך שניתן על ידי webtool. לפריימרים> 20 NT, להשתמש טמפרטורת חישול 3 ° C גבוה מ Tm הנמוך שניתן על ידי webtool. רכיבים 20 תגובת μl Conc הסופי. H 2 O להוסיף עד 20 μl 2x Phire בעלי חי רקמות PCR המאגר 10 μl 1x פריימר X μl 0.5 מיקרומטר B פריימר X μl 0.5 מיקרומטר Phפולימראז הזעם החם התחל השני דנ"א 0.4 μl מדגם / דילול פרוטוקול μl 1 לוח 3. תנאי תגובה לבעלי חי הרקמות PCR משמש בפרוטוקול זה. שלב מחזור טמפ. זמן מחזורים denaturation הראשוני 98 מעלות צלזיוס 5 דקות 1 Denaturing חישול * הארכה 98 מעלות צלזיוס X ° C 72 ° C 5 שניות 5 שניות 20 שניות ≤ 1 ק"ג 20 שניות / kb> 1 ק"ג 40 הארכה סופית 72 ° C 4 מעלות צלזיוס 1 דקות להחזיק 1 לוח 4. תנאי רכיבה על אופניים לבעלי חי הרקמות PCR משמשים בפרוטוקול זה. * מחשבון Tm בwww.thermoscientific.com / pcrwebtools מומלץ בעת קביעת Tm לפריימרים לשימוש עם פולימראז Phire החם התחל השני דנ"א. הטמפרטורה המומלצת לחישול פריימרים ≤ 20 nt שווה לTm הנמוך שניתן על ידי webtool. לפריימרים> 20 NT, להשתמש טמפרטורת חישול 3 ° C גבוה מ Tm הנמוך שניתן על ידי webtool. איור 1. הישיר PCR זרימת העבודה. הישיר PCR יכול להתבצע באמצעות שני פרוטוקולים חלופיים. בפרוטוקול הישיר כמות זעירה של המדגם הוסיף ישירות למחשבR תגובה. פרוטוקול הדילול מעסיק צעד מראש דגירה קצר לפני PCR לשחרר DNA מהחומר המדגם. איור 2. Genotyping של יחידים צמחים ארבידופסיס עם טכניקת dCAPS ישירות מאגרופי עלים. ) 2A האיור מציג את העיקרון של assay dCAPS בצע. אתר ההגבלה בתוך SNP של עניין הוא הציג או להסיר על ידי PCR באמצעות פריימר עם חוסר התאמה אחת או יותר לדנ"א היעד. מוצרי PCR מתעכלים ושהברים הנובעים לחשוף את הגנוטיפ של כל פרט כאשר נותחו על ידי אלקטרופורזה. B) 0.50 אגרופי מ"מימ מעלי הצמח הונחו ישירות ב 50 תגובות PCR μl. את 160 מוצרי BP PCR המכילים אתר SNP (G או אלל) היו מוגברים עם פריימרים מציגים אתר SSPI ייחודי ל- אלל. מוצרי PCR unpurified היו digesטד עם אנזים הגבלת SSPI. שברים כתוצאה נותחו על 3% agarose ג'ל. הליין M הוא סמן הגודל; נתיבים וG המתאימים לאללים SNP של כל דגימה. התוצאות שהתקבלו אושרו על ידי ניתוח קונבנציונלי של מיצוי DNA בעקבות PCR ועיכול הגבלה (מידע לא מוצג). התגובות השליליות ללא הבקרה DNA התבנית נכללו במבחן להגדיר ולהפעיל על ג'ל agarose נפרד במקביל לתגובות PCR בפועל לפני ביצוע digestions (מידע לא מוצג). איור 3. פרוטוקול דילול באמצעות דגימות עלים מעץ אלון. פרוטוקול הדילול שמש כדי להגביר הבר 297 נ"ב של DNA chloroplastic בדגימות עלים מעץ אלון (פרוטוקול 3-צעד, חישול ב 62 מעלות צלזיוס) בדילולים שונים (1:100, 1:10, 1 : 1 ו2:1) ונגד חיובי ושליליtrols [C +: ביקורת חיובית ממטוהרי DNA (ארבידופסיס), C-: שליטה שלילית ללא דנ"א תבנית]. מינוח המדגם מייצג את אתר מדגם האוסף (ערים בפינלנד) ומדגם מספור. איור 4. Genotyping של עכברים הטרנסגניים עם זוג פריימר אחד באמצעות פרוטוקול הדילול. רקמות אוזן של תשעה עכברים בודדים (נתיבים 1-9) הונחו ל20 μl של מאגר הדילול כולל תוסף DNARelease. לאחר incubations בטמפרטורת חדר ו98 מעלות צלזיוס, μl 1 מתוך supernatant שמש כתבנית בתגובת PCR 20 μl. גדלי Fragment: 1500 BP (מהונדס) ו200 נ"ב (wildtype). איור 5. דגימות שהוכנו על פי פרוטוקול הדילול הם יציבים לאחסון ארוך טווח. דוגמאות של רקמות אוזן עכבר היו inc ubated ב20 μl של מאגר הדילול כולל תוסף DNARelease ונתונה להקפאה חוזרת / פשרה (1 שביל), מאוחסן ב -20 ° C לשנה אחת (מסלול 2), או להשתמש באופן מיידי לPCR (3 נתיבים). גדלי הבר המוגבר היו 900 נ"ב, BP ו1500 3200 BP. איור 6. Phire בעלי חי רקמות ישירות PCR ערכת ביצועי מערכת טיהור דנ"א מסחרית בשילוב עם DNA פולימראז החם תחילת תקי. ארבע amplicons (0.5-1.5 ק"ג) היה מוגברת מרקמות אוזן עכבר תוך שימוש בפרוטוקול הדילול של קיט Phire בעלי חי רקמות ישירות PCR. לשם השוואה, ה-DNA, מזוכך ראשון באמצעות ערכת חילוץ דנ"א מסחרית ואותם הברים היו מוגברים באמצעות DNA פולימראז חם תחילת Taq לפי המלצות של היצרנים. רק עם בעלי חי Phire הרקמות הישירות PCR הקיט היה כל הארבעה amplicons מוגבר בהצלחה. t "> איור 7. השוואה אוניברסלית של העבודה עם הערכת זמנים / ריאגנטים נצרכים. גישה המדעית Thermo הישירה PCR בהשוואה לגישת ה-DNA הבידוד, גישת חיץ החילוץ, וגישת חיץ PCR. הזמן המשוער לכל גישה לפני צעד PCR מופיע בטקסט אדום. הגישה המדעית Thermo הישירה PCR לוקחת רק 0-4 דקות להכנת מדגם לפני PCR. מתחת לכל שיטה, ריאגנטים צרכו רשומים. הגישה המדעית Thermo הישירה PCR משתמשת את הכמות המינימאלית של חומרים כימיים בהשוואה לשיטות האחרות. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.