Genotypering van plantaardige en dierlijke monsters zonder voorafgaande DNA-zuivering

1. Genotypering van Arabidopsis Plant Personen met Direct Protocol De dCAPS genotyperingstest direct in op de Arabidopsis plant blad eerst formuleren 20 of 50 ul PCR reactie met de Phire Plant Direct PCR Kit zoals beschreven in Tabel 1. Daarna, snijd een 0,50 mm pons van een Arabidopsis plant blad met behulp van de Harris Uni-Core en Harris snijmat. Houd de puncher stevig, drukt u op de snijkant in het weefsel en draai de puncher heen en weer. Druk op de zuiger om de punch disc uit te werpen in een PCR-reactiemengsel. Zorg ervoor dat het monster valt in de PCR-oplossing en plakt niet aan de buis muren. Reinig de snijkant van de puncher na elk monster om kruisbesmetting te voorkomen door dompelen in 2% NaClO oplossing. Druk op de zuiger op en neer een paar keer en wrijf de snijkant met een schone papieren handdoek. De snijmat moet ookgespoeld tussen de monsters. Vervolgens gebruik van een Thermo Scientific Piko 24-well Thermal Cycler en Thermo Scientific Piko PCR Plate de PCR reacties met de fietsomstandigheden beschreven in tabel 2 uitgevoerd. De PCR reacties kunnen worden uitgevoerd in conventionele PCR thermocyclers. Na PCR, spin down het plantmateriaal. Breng 5 ul van het supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg 4 pi water en 1 pl restrictie-SspI. Meng voorzichtig en kort draaien tot inhoud op de bodem van de buis. Incubeer het reactiemengsel gedurende een uur bij 37 ° C. Inactiveren het restrictie-enzym door incubatie bij 65 ° C gedurende 20 minuten. Wanneer amplificeren DNA rechtstreeks uit plantenweefsel, de PCR producten omvatten planten-en PCR-afgeleide componenten die kunnen interfereren met de restrictiedigestie enzym. Daarom kan het nodig zijn een verdunnen (bijvoorbeeld 1:2 of 1:3 in water) en het PCR product te zuiveren voordat thij daaropvolgende digestie, bijvoorbeeld door een geschikte commerciële kit zoals Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit. Na restrictie-enzym digestie, analyseren de resulterende fragmenten op agarose gel. Voeg 2,5 ul 5x loading buffer aan de reactie en uitvoeren agarose gelelektroforese met 10 ul van het verkregen mengsel. 2. Versterken specifieke DNA-fragmenten van 15-jaar oude Oak Leaves met behulp van het verdunningssysteem Protocol Om te beginnen, snijd een 2 mm punch van eiken blad. Plaats het monster in 20 ul van Dilution Buffer geleverd met de Phire Plant Direct PCR Kit. Reinig de snijkant van de puncher en snijmat als voorheen. Plet het blad monster met een 100 ul pipet door het kort tegen de buiswand. Afhankelijk van het plantmateriaal, de verdunning protocol werkt soms beter zonder deze te beschadigen het monster. Kort draaien de monsters in een microcentrifuge tot tHij reacties zijn op de bodem van buizen. Het supernatant kan direct worden gebruikt in de PCR, of kan worden verdund 1:10 of 1:100 in steriel water afhankelijk van het type monster. Gebruik 0,5 pl tot 1 ul van het supernatant of verdunnen als sjabloon voor een 20 pi PCR-reactie. Bereid de reactie als beschreven in tabel 1. Zodra de reacties worden bereid, gebruik van een Thermo Scientific Piko 24-well Thermal Cycler en Thermo Scientific Piko PCR Plate de PCR reacties met de fietsomstandigheden beschreven in tabel 2 uitgevoerd. De PCR reacties kunnen worden uitgevoerd in conventionele PCR thermocyclers. Na PCR, voeg 5 pl 5x loading buffer aan de reactie en uitvoeren agarose gelelektroforese met 15 pi van het resulterende mengsel. 3. Genotypering van transgene muizen met behulp van het verdunningssysteem Protocol Begin de verdunning protocol over transgene muizen door het plaatsen van een 2 mm punch van de mouse oor in 20 pl Dilution Buffer die 0,5 pi DNARelease Additive geleverd met de Phire Animal Tissue Direct PCR Kit. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 2 min, gevolgd door 2 min incubatie bij 98 ° C. Kort draaien de monsters in een microcentrifuge tot de reacties op de bodem van buizen. Gebruik 1 pi supernatant als de template voor een PCR reactie 20 pi, bereid zoals beschreven in Tabel 3. Elke supernatant die niet direct worden gebruikt, kan worden overgebracht naar een nieuwe buis en opgeslagen bij -20 ° C. Vervolgens gebruik van een Thermo Scientific Piko 24-well Thermal Cycler en Thermo Scientific Piko PCR Plate de PCR reacties met de fietsomstandigheden beschreven in Tabel 4 voeren. Opnieuw kan de PCR reacties worden uitgevoerd in conventionele PCR fietsers. Na PCR, voeg 5 pl 5x loading buffer aan de reactie en uitvoeren agarosegelelektroforese wi 15 pi van het resulterende mengsel. 4. Representatieve resultaten In de techniek dCAPS de restrictieplaats in de SNP plaats wordt geïntroduceerd of vernietigd met een PCR primer met een of meer mismatches aan het doel DNA. Genotypering van Arabidopsis planten individuen werd uitgevoerd met de dCAPS techniek direct van blad stoten. De geamplificeerde producten werden geknipt en de resulterende fragmenten waaruit het genotype van elk individu werden geanalyseerd door gelelektroforese (figuur 2). In dit voorbeeld werden de 160 bp PCR producten die de SNP-plaats van belang (G of A allel) in het Arabidopsis genoom geamplificeerd uit plantaardige bladuitsnijdingen de Phire Plant Direct PCR Kit. De voorwaartse primer bevatte een mismatch op het 3'-uiteinde, waardoor een SspI-specifieke restrictieplaats in het doelwit DNA, die de SNP plaats (A allel) maar nietin het andere allel van de SNP (Figuur 2B). Verdunning protocollen nodig zijn voor veeleisende plantmateriaal, zoals eikenblad, vanwege de hoge concentratie van fenolische verbindingen. Met de verdunning hier beschreven protocol werd het 297 bp fragment van chloroplast DNA geamplificeerd met de 3-staps protocol. Eikenblad specimens met verschillende verdunningen zijn weergegeven in figuur 3, naast positieve en negatieve controles. De Phire Animal Tissue Kit Direct PCR werd toegepast met een uitdagende protocol waarin slechts een primer set was voor amplificatie van twee fragmenten gebruikt met een groot formaat voortvloeiende verschil in overvloedige opbrengsten van beide juiste grootte van 1.500 bp producten voor transgene muizen en 200 bp voor wild type muizen (figuur 4). De zwakkere bovenste band met heterozygote muizen door concurrentie van beide templates (allelen) voor hetzelfde primerpaar, maar de genotyping resultaten zijn eenduidig. De stabiliteit van de monsters bereid met de verdunning protocol werd ook getest. De resultaten tonen aan dat de verdunning monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende ten minste een jaar. Bovendien heeft herhaalde vries / dooicycli geen significante invloed op de reactie (Figuur 5). Ook getoond is de sterke amplificatie van muizenoor weefselmonsters met Phire DNA Polymerase en Direct PCR methode ten opzichte van hot start Taq polymerase en gezuiverd DNA (Figuur 6). Componenten 20 ui reactiemengsel 50 ul reactie Eindconc. H 2 O In 20 ui In 50 ul 2x Phire Plant PCR Buffer 10 pi 25 pi 1x primer A X pi X pi 0,5 uM primer B X pi X pi 0,5 uM Phire Hot Start II-DNA-polymerase 0,4 pl 1 pi Voorbeeld / directe protocol 0,50 mm punch Voorbeeld / verdunning protocol 0,5-1 ul Tabel 1. Reactie-omstandigheden voor Plant PCR gebruikt in dit protocol. Cycle Stap Temp. Tijd Cycli Initiële denaturatie 98 ° C 5 min 1 Denaturerende Gloeien * Uitbreiding 98 ° C X ° C 72 ° C 5 sec 5 sec 20 sec 40 Laatste verlenging 72 ° C 4 ° C 1 min houden 1 Tabel 2. Cycling voorwaarden voor Plant PCR gebruikt in dit protocol. * De Tm calculator oposcientific.com / pcrwebtools "target =" _blank "> www.thermoscientific.com / pcrwebtools wordt aanbevolen het bepalen van de Tm voor primers voor gebruik met Phire Hot Start II DNA Polymerase. de aanbevolen temperatuur voor annealing primers ≤ 20 nt is gelijk aan de lagere Tm die de webtool. primers voor> 20 nt, met een hybridisatietemperatuur 3 ° C lager dan de lagere Tm door de webtool. Componenten 20 ui reactiemengsel Eindconc. H 2 O In 20 ui 2x Phire dierlijk weefsel PCR Buffer 10 pi 1x primer A X pi 0,5 uM primer B X pi 0,5 uM Phire Hot Start II-DNA-polymerase 0,4 pl Voorbeeld / verdunning protocol 1 pi Tabel 3. Reaction voorwaarden voor dierlijk weefsel PCR gebruikt in dit protocol. Cycle Stap Temp. Tijd Cycli Initiële denaturatie 98 ° C 5 min 1 Denaturerende Gloeien * Uitbreiding 98 ° C X ° C 72 ° C 5 sec 5 sec 20 sec ≤ 1 kb 20 sec / kb> 1 kb 40 Laatste verlenging 72 ° C 4 ° C 1 min Houden 1 Tabel 4. Cycling voorwaarden voor dierlijk weefsel PCR gebruikt in dit protocol. * De Tm rekenmachine www.thermoscientific.com / pcrwebtools wordt aanbevolen het bepalen van de Tm voor primers voor gebruik met Phire Hot Start II DNA Polymerase. De aanbevolen annealing temperatuur primers ≤ 20 nt is gelijk aan het laagste Tm door de webtool. Voor primers> 20 nt, met een hybridisatietemperatuur 3 ° C lager dan de lagere Tm door de webtool. Figuur 1. Directe PCR workflow. Direct PCR kan worden uitgevoerd met twee alternatieve protocollen. In de directe protocol een kleine hoeveelheid monster wordt direct aan de PCR reactie. De verdunning protocol gebruikt een korte pre-incubatiestap voor PCR om DNA vrij te maken uit het monster. Figuur 2. Genotypering van Arabidopsis planten personen met dCAPS techniek direct van blad stoten. A) Figuur 2A toont het principe van de dCAPS assay uitgevoerd. De restrictieplaats in de SNP plaats wordt geïntroduceerd of verwijderd door PCR met een primer met een of meer mismatches aan het doel DNA. De PCR-producten worden gedigereerd en de resulterende fragmenten blijkt het genotype van elk individu wanneer geanalyseerd door elektroforese. B) 0,50 mm ponsen van bladeren werden direct in 50 pi PCR-reacties. Het 160 bp PCR producten die de SNP-plaats (G of A allel) werden geamplificeerd met primers invoering van een unieke Sspl plaats van de A-allel. Het ongezuiverde PCR producten werden spijsverteringted met Sspl restrictie-enzym. Resulterende fragmenten werden geanalyseerd op een 3% agarose gel. Laan M is de grootte marker, banen A en G corresponderen met de SNP allelen van elk monster. De verkregen resultaten werden bevestigd door conventionele analyse van DNA extractie gevolgd door PCR en restrictiedigestie (data niet getoond). De negatieve controle reacties zonder template DNA werden in testopstelling en uitgevoerd op een aparte agarose gel in parallel met de werkelijke PCR reacties voordat de vertering (data niet getoond). Figuur 3. Verdunning protocol met eikenblad. Uit de verdunning protocol werd gebruikt om de 297 bp fragment van chloroplast DNA in eikenblad monsters (3 stappen protocol, annealing bij 62 ° C) amplificeren bij verschillende verdunningen (1:100, 1:10, 1 : 1 en 2:1) en positieve en negatieve controles [C +: positieve controle van gezuiverd DNA (Arabidopsis), C-: negatieve controle zonder template DNA]. Het monster nomenclatuur is de monstername site (steden in Finland) en het monster nummering. Figuur 4. Genotypering van transgene muizen met een primer paar met de verdunning protocol. Ear weefsels van negen individuele muizen (lanen 1-9) werden in 20 ui Dilution Buffer met inbegrip DNARelease Additive. Na incubaties bij kamertemperatuur en 98 ° C, 1 pi supernatant werd gebruikt als een template in de PCR-reactie 20 pl. Fragment maten: 1.500 bp (transgene) en 200 bp (wildtype). Figuur 5. Monsters bereid volgens de verdunning protocol zijn stabiel voor langdurige opslag. Monsters van muisoor weefsels waren inc ubated in 20 pl Dilution Buffer met inbegrip DNARelease Additieve en onderworpen aan herhaalde bevriezing / ontdooien (laan 1), bewaard bij -20 ° C gedurende een jaar (baan 2), of direct gebruikt voor PCR (laan 3). Het geamplificeerde fragment maten waren 900 bp, 1500 bp en 3200 bp. Figuur 6. Phire dierlijk weefsel Direct PCR Kit presteert beter dan een commerciële DNA-zuivering in combinatie met een warme start Taq DNA-polymerase. Vier amplicons (0,5-1,5 kb) werden geamplificeerd uit muisoor weefsels met behulp van de verdunning protocol van Phire dierlijk weefsel Direct PCR Kit. Ter vergelijking werd eerst gezuiverd DNA met een commerciële DNA extraction kit en dezelfde fragmenten werden geamplificeerd met behulp van een hot start Taq DNA polymerase volgens aanbevelingen van de fabrikant. Alleen met de Phire dierlijke weefsel Direct PCR Kit waren alle vier de amplicons met succes versterkt. t "> Figuur 7. Universele vergelijking van de werkstroom schatting van times / verbruikte reagentia. Thermo Scientific Direct PCR benadering wordt vergeleken met de DNA isolatie benadering de extractiebuffer benadering en de PCR buffer benadering. De geschatte tijd voor elke benadering voor de PCR stap wordt weergegeven in rood. De Thermo Scientific Direct PCR aanpak duurt slechts 0 tot 4 minuten voor de monstervoorbereiding voorafgaand aan de PCR. Onder elke methode worden de verbruikte reagentia genoemd. De Thermo Scientific Direct PCR benadering maakt gebruik van de minste hoeveelheid van de reagentia in vergelijking met de andere methoden. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .