İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

1. Büyüyen fidan ve hazırlanması Bakteriler Fideler bir büyüme oda (22 az 8 saatlik bir ışık periyodu ile 160 ľmol fotonlar m -2 s -1 MetroMix 500 toprak karışımı (BWI ​​Şirketler) içinde çimlenmiş olan 20 karanlık ° C ve 16 saatlik ° C 1 hafta boyunca. Bağıl nem oranı% 70 olarak saptanmıştır. kuru hale gelen toprak tutmak için gerektiği gibi fideler musluk suyu ile sulandı. Benzer büyüklükteki iki fidan sonra MetroMix 500 toprak içeren 4 "çap tencere nakledilen ve 1.1 aynı koşullarda ek olarak 3 hafta boyunca yetiştirilir. Pseudomonas syringae (Pst) Kings Yatak Orta (KBM) plakaların (litre başına: 20 g proteoz Peptonlu, 0,1975 g MgSO 4,% 1 Gliserol, 1,5 g K 2 HPO 4, 18 g Agar) üzerine ilk T-çizikli ve yetiştirilen 28 az iki gün ° C. Tek bir koloni 300μl sıvı Kings karıştırılarak, toplanan B Orta (20 g proteoz pepton, 0,1975 g MgSO 4 </sub>, 10 mL gliserol, 100x K 2 HPO 4 stokunun 10 ml (H 2 O 10 mL K 2 HPO 4 1,5 g), ve Kings B levha üzerine yayılmıştır. Bu 28 ° C'de gece boyunca kültürlenir Bakteriler inokulum 20 mL H 2 O. içine KBM plakadan kültüre bakteri kazıma ile hazırlanır 0,03 bir OD 600 (~ 10 6 cfu / ml), (10 mM MgCl2 + 400 uL Silwett-70) inokulasyon tamponu 1 L içinde hazırlanır. Aşılama tampon eksi bakterileri kontrol çözümü için hazırlanmıştır. 2. Pst ve H 2 O 2 ile Domates Aşılama Leke Histokimyasal Dört haftalık bitkiler 30 saniye için yukarıdaki aşılama çözüm içine batırarak ekildi. Şeffaf plastik poşet inokülasyondan hemen sonra bitkilerin üzerine konuldu. 3'-3 'diaminobenzidin (DAB) 11 (H2O içinde 1 mg / ml DAB, pH 3.8 (HCI)) üç d hazırlandı lekeays önce tam çözünürleştirme ulaşmak için kullanabilirsiniz. Çözelti, oda sıcaklığında karıştırarak sallandı edildi. Yirmi dört saat tedaviden sonra, tam genişletilmiş yaprak epidermal tarafı yukarı leke DAB yerleştirilir, kaldırılır, ve vakum 15 dakika infiltre edildi. Yaprakları daha sonra boyama için gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta konuldu. Yapraklar 10 dakika süreyle% 95 etanol içinde kaynatıldı ve sonra% 75 etanol içinde tutuldu. 3. Protein Ekstraksiyonu Hasattan sonra, domates yaprakları havanda kullanarak sıvı nitrojen ile ince toz topraklı edildi. Doku 0.5 g, 1.25 mL fenol Tris pH 8.8 tamponlu ekleyin ve ekstraksiyon tamponu 1.25 mL / 0.5 g (0.1 M Tris-HCI pH 8.8, 10 mM EDTA, 0.9 M sukroz) daha sonra bir de birkaç dakika için devam taşlama çeker ocak. Oakridge santrifüj tüpü (Termo Fisher Scientific Nalgene Company) ile özü aktarılır ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca ajite. 5000 xg'de santrifüjleyinve 15 ° C'de 10 dakika süreyle. Yeni ve temiz bir tüpe üst fenol fazı aktarın. Eşit hacimde Back-ayıklamak sulu faz fenol tampon ayıklanır; 30 dakika için bir çalkalayıcı kışkırtma. Santrifüj ve yeni bir Falcon tüpüne özü aktarmak. Yukarıdaki adım bir kez daha tekrarlayın ve yeni Oakridge tüpüne özü aktarmak. % 100 metanol (-20 ° C de muhafaza) içinde 0.1 M amonyum asetat 5 hacim ekleyerek fenol ekstre proteinleri çöktürmek. Gece boyunca -20 ° C'de Vortex ve kuluçkaya yatmaktadır. 20 dakika için 20,000 xg, 4 ° C'de santrifüje edilerek proteini pelet Collect. % 80 soğuk aseton ile, metanol ve 2 kez soğuk 0.1M amonyum asetat ile pelet 2 kez yıka. Pelet için 1.5 ml soğuk% 70 etanol ekleyin ve askıya. 20 dakika süre ile, bir 2 mL mikrosantrifüj tüpü (ABD Scientific) ve 14,000 rpm'de santrifüj, 4 ° C transfer. Etanol çıkarın. Bir SpeedVac konsantratör yılında pelet kısaca kurulayın ve bir protein extr boşanmakişlem tampon, örneğin ReadyPrep Protein Ekstraksiyon Kit Reaktif 3 (8 M üre,% 4 CHAPS, 40 mM Tris-bazlı, 2 M Thiourea) (Bio-Rad). Bir pelet oluşturmak üzere 30 dakika süreyle 14.000 rpm ve 20 ° C'de santrifüje. Süpernatant toplayın. Üreticinin kılavuzu (Geno Teknolojisi) göre CB-X protein metodu kullanılarak protein konsantrasyonu ölçün. 4. CysTMTs ile Numune Hazırlama ve Peptid Etiketleme 2-5 mg / ml arasında derişimde protein numunesinin hazırlanması. Burada, her kitle etiketi için 20 ul-50 uL örneklerinin protein 100 mg kullanın. Bu deneme için tüm 6 etiketler kullanılmıştır. Serbest tiyol grubu engellemek için protein örnek alkilasyon tampon eşit hacimde (100 mM Tris-HCI, pH7.5, 200 mM iyodoasetamid) eklenir. Tampon taze olarak hazırlanması gerekir. Alkilasyon 1 saat boyunca 37 ° C'de gerçekleştirilir. Gece boyunca -20 ° C'da soğuk% 80 aseton 1 ml ilave edilerek proteini çöktürmek. 14.000 santrifüj Pelet proteinrpm, 4 ° C'de 20 dakika süreyle. Her vorteks% 80 aseton ile pelet 3 kez yıkayın. Süpernatantı ve buz üzerinde kuru iken yayınlamaya izin verir. 50 uL lizis tamponu (6 M üre, 50 mM Tris baz, 1 mM EDTA) içinde pelletini. 100 mM Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) 0,5 uL daha sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca kuluçkaya disülfid bağları azaltmak için eklenir. Etiketleri çözünürleştirmek için reaktif tüplerinin asetonitril 20 uL ekleyerek etiketler hazırlayın. Vortex ve dibine kadar dönerler. Bir Microcon 3KD santrifüj filtre cihazı (Millipore) kullanılarak ekstra TCEP yıkayın. Microcon 3KD sütuna 50 uL örnek ekleyin ve sütun 50 uL lizis tamponu. 10,000 xg, 4 ° C'de 15 dakika süre ile santrifüje Üç kez toplam için bu adımı yineleyin. Sütun çıkarın ve temiz bir tüpe ters çevirin. 1.000 xg ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin PH kontrol edin. Gerekirse, 1 M HCl ile 7,0-8,0 pH üzere ayarlanır. CysTM 5 uL eklemeHer numune (cysTMT reaktif kiti 500 mikrogram protein için 20 uL etiketleri sağlar. Bu yöntemi biz etiketi beşte birini kullanabilirsiniz bu nedenle, 100 mg protein kullanır.) T reaktifi. Oda sıcaklığında 2 saat için ilerlemeye reaksiyon izin verir. Numuneler, bir 1:1 oranında Laemmli numune tamponu (Bio-Rad) ile kombine edilmiştir. 5.. Sigara tepki Tag Örnek Fraksiyonu Uzaklaştırılması Numuneler 5 dakika kaynatıldı ve bir ön-dökme 12% poliakrilamid jel (Bio-Rad) üzerine ayrıldı. Jel süzüldü H2O ile 5 dakikalık aralıklarla üç kez yıkanır ve 1 saat için Coomassie Mavisi (Bio-Rad) ile boyanmıştır. Jel H 2 O ile birlikte bir gece de lekeli oldu Oniki kesirler her jel şeridi toplanmıştır. Kesirler, protein grubu konsantrasyonları tayin edildi. Fraksiyonlar 1mm parçalar halinde kıyılmış ve 1.5 mL tüp içine toplanmıştır. Jel adet 2 H,% 50 asetonitril ve 0.1 M amonyum bikarbonat ile de-lekeli idi </alt> O. Mavi renk jel parçaları (~ 3-4 kez, 15 dakika her zaman) kaldırılıncaya kadar bu adımı tekrar edilmelidir. De-lekeli jel adet 15 süpernatan kaldırılır dak, ve bir SpeedVac kullanılarak kurutulur parçaları için,% 100 asetonitril (jel parçaları kapsar) kullanılarak kurutulmuştur. 25 mM amonyum bikarbonat aynı hacimde (as toplanmış etiketli örnek) oran: 1:10 tripsin (Promega) (protein tripsin) eritin. Örneğin, 500 ul'lik bir hacimde 600 ug protein Örnek 25 mM amonyum bikarbonat, 500 uL içinde çözülmüş 60 mg tripsin ihtiyacı vardır. Jel parçalara tripsin çözüm ekleyin ve rehidratasyonu için buz üzerinde ayarlayın. Adet kapalı değilse 50 mM amonyum bikarbonat tampon ekleyin. Rehidrasyon sonra, 12-16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. İnkübe örneklerden sıvı protein ekstresi çıkarın. Reaksiyon durdur ve% 5 formik asit,% 50 asetonitril ile jel parçaları kaplayarak kalan herhangi bir protein özeti kaldırmak .. Oda te de 20 dakika boyunca sallayın jel parçamperature. 5.7 ayıklanan protein örnek tüpleri süpernatant aktarın. Iki kez çıkarma işlemi tekrarlayın. SpeedVac kullanarak ayıklanan peptidler kurulayın. 6. CysTMT Etiketli-peptidlerin Numune Zenginleştirme Bir 50% bulamaç için 0.5 mL tüplere anti-TMT reçine bir gradyan ekleyin. (Gradient fraksiyonlama jel bant konsantrasyonu belirlendi. Bir fraksiyon toplama karanlık bir grup oluşur, daha fazla reçine gereklidir. Az protein olduğu gibi zayıf bantları Kesirleri az reçine gerektirir.) Reçine daha sonra 1 x biri sütun hacmi ile üç kez yıkanır Tris tamponlu tuz (TBS) (25 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH 7.2) (Termo Scientific Pierce Protein Research Products). Her numune için 200 ul 1xTBS ekleyin. Numuneler daha sonra, anti-TMT reçinesi (Termo Scientific Pierce Protein Research Products) ilave edildi ve 4 ° C de bir gece boyunca sallanan ardından 2 saat boyunca oda sıcaklığında çalkalanır Sütun (için örnek ekleRMO Bilimsel Pierce Protein Araştırma Ürünleri). 1x 200 ul TBS ile her sütunun üç kez yıkayın. Bu, daha sonra% 0.05 CHAPS (1x TBS içinde çözülmüş) ile üç kez yıkama ile takip eder. Sütun sonra TBS 1x 4 M üre ile üç kez yıkanır. H2O iki yüz mikrolitre sonra sütun üç kez yıkamak için kullanılır. Her bir numune, 200 uL% 50 elüsyon tamponuyla (% 50 asetonitril,% 0,4 TFA) ile üç kez yıkandı edilir. Numuneler daha sonra, bir yoğunlaştırıcı vakum içinde kurutulur. 7. Kütle Spektrometresi Analizi % 0.1 formik asit ile% 3 asetonitril 12 uL içinde tekrar süspansiyon örnekleri ve bir Eksigent NanoLC-1B, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi, kolon (AB Sciex, USA) üzerine direkt olarak enjekte 5 ul. Peptitler bir Proteopep II C18 kolonu 75 mikron kimliği ayrılacak bir 4-60% eğim (A kullanarak x 20 cm (Yeni Amaç, ABD):% 3 asetonitril,% 0.1 formik asit, B:% 97 asetonitril,% 0.1 formik asit)3 azından uL / ​​60 dakika zarfında dak. Bir Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL kütle spektrometresi tek aşamalı MS oluşan x 3 deney 3 MS tarafından takip yüksek enerji C-trap dissosiyasyon (HCD) parçalanması ile MS / MS spektrumları 3 edinimi ardından bir üst 2 ile peptitler algılamak için kullanılan Protein tespiti için çarpışma kaynaklı dissosiyasyon (CID) ile / MS. Bu modda parametreleri: İzolasyon genişliği: 3,0 m / z; Çarpışma enerji:% 50 (iki aşamalı olarak% 10). Sadece iki kat-ı üç kat ücret ve peptidler parçalanması için seçildi. Dinamik dışlama parametreler belirlendi: = 1 saymak tekrarlayın; Tekrar Süre = 60; Bırakma listesi size = 500; Dışlama süresi = 28. Aşağıdaki gibi hedef değer vardır: MS = 5 e 5; MS / MS (HCD) = 1 e 5. İyon transferi kez MS / MS (HCD) için FTMS ve 300 için 500 ile belirlenmiştir. İki microscans HCD spektrumları için gerekli edildi. 8. Veritabanı Arama ve Miktar Kazanılmış CID ve HCD veriler vardıoranını ölçmek için bir Reporter Ion Quantizer (fragman iyonların 20 ppm kütle toleransı) uygulanan bir dallı iş akışı aracılığıyla Thermo Scientific Proteom Discoverer yazılımı 1.2 (Thermo Scientific Pierce Protein Araştırma Ürünleri) kullanarak nalyzed. Ayrı bir bölüm Spectrum Seçici, Spektrum Normalizer ve Spektrum Orfoz düğümleri arasında MS 2. spektrumları işlenmiş. Veriler daha sonra SEQUEST arama motoru karşı arandı. A 20 ppm kitle hoşgörü kullanılmıştır. Statik değişiklikler cysTMT reaktifi olarak (304,18 Da) ve dinamik değişiklikler fosforilasyon ve metionin oksidasyon (15.99 Da) dahil edildi. Solanum lycopersicum için özel bir veritabanı RNA veri (Harvard Üniversitesi'nde yaklaşık 350.000 girdileri ile) 13 her iki durumda da kullanılan kullanarak bestelendi. 9. Temsilcisi Sonuçlar Bir kontrol domates bitkisi yaprak ve Pseudomonas inoküle yaprak temsilcisi görüntüŞekil 1'de gösterilmiştir. Uygulanan kontrol ve Pseudomonas tedavi yaprakları arasında bir farklılık gözlenmiştir. Yapraklar çıkarılır ve de-boyama işlemi yaprak dokusunda ROS belirtileri (Şekil 2) göstermek için histokimyasal sağlar. DAB, kullanılarak boyandı sonra Şekil 2A boyanma bir kontrol yaprak temsilcisidir. Şekil 2B temsilcisi H 2 O 2 üretimi için Pseudomonas ve boyanma ile tedavi edilen bir yaprak. Bir redoks farklı şekilde düzenlenmiş protein Proteome Discover verilerin çıkış için bir örnek Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bu protein bilinen bir redoks düzenlenmiş protein ferrodoksin-1 14 ve Pseudomonas syringae pv domates 15 karşı savunmada rol oynadığı gösterilmiştir. Kontrol ve aşılanmış örnekleri arasında pik yoğunluk ferredox önemli değişiklikler gösterdi Göreceli ölçüm, elde etmek için kullanılırin-1 redoks regülasyonu (p <0.05). Yüksek yoğunluklu zirveleri bu proteinin patojen tedaviye yanıt olarak okside olduğunu göstermiştir. Şekil 4, bir kontrol ve aşılanmış örnek arasındaki bir proteinin benzer redoks düzenlemesi olan bir proteini Proteome Discover veri çıkışı bir örnektir. Benzer yoğunluk Peaks tedavisinde bir değişiklik ile düzenlenmeyen disülfit bağlarını varlığını düşündürmektedir. Yöntem bilim adamları redoks duyarlı sistein ve disülfitler 10 algılamak nasıl devrim olacaktır. Şekil 1. Inoküle domates temsili bir görüntü kontrol çözeltisi (A) ve Pseudomonas (B) ile ayrılır. <span class = "pdflinebreak"> Şekil 2. Aşılanmış domates DAB boyama temsilcisi görüntü kontrolü çözümü (A) ve Pseudomonas (B) bırakır. Yapraklar 3'-3 'diaminobenzidin kullanılarak boyanmıştır. Klorofil% 95 etanol içinde kaynatılarak yapraklar çıkarıldı. Koyu boyama H 2 O 2 varlığını gösterir. Sadece bakteri kültürü koyu boyanma gösterdi inokule bırakır. Şekil 3. Ferrodoksin-1 Proteome Discover veri çıkışı, farklı şekilde düzenlenmiş redoks proteini 14 bir örneği. Her bir tepe Yukarıda tepe yoğunluğu mutlak nicelendirilmek üzere kullanılır. Kontrol ve aşılanmış örnekleri arasında pik yoğunluk kullanılırGöreceli ölçüm gerçekleştirmek için. Şekil 4. Bir kontrol ve inoküle örnek arasındaki benzer tepe yoğunluğu olan bir proteinin Proteom Discover veri çıkışı bir örnek. Benzer yoğunluk Peaks tedavisinde bir değişiklik ile düzenlenmeyen disülfit bağlarını varlığını düşündürmektedir.