Profiling Proteome Redox tiol Usando Isótopos Espectrometria de Massa Tagging

1. Produção de mudas e bactérias Preparação As plântulas são germinadas em Metromix mistura de solo 500 (Companies IBW) numa câmara de crescimento (160 umol fotões m -2 s -1 com um fotoperíodo de 8 horas de luz a 22 ° C e 16 horas escuro a 20 ° C durante 1 semana. Relativa humidade foi ajustada para 70%. As plântulas foram regadas com água da torneira, conforme necessário para manter o solo de secarem. Duas mudas de tamanho semelhante são então transplantadas para vasos de 4 "de diâmetro contendo o solo 500 Metromix e cultivadas durante mais 3 semanas nas mesmas condições que 1,1. Pseudomonas syringae (PST) é inicialmente T-listado na Kings B Médio (KBM) placas (por litro: 20 g peptona proteose, 0,1975 g MgSO4, Glicerol 1%, 1,5 g de K 2 HPO 4, 18 g Ágar) e crescidas durante dois dias a 28 ° C. Uma única colônia é coletado, misturado em 300 l Reis líquido B Médio (20 g Proteose peptona, 0,1975 g MgSO 4 </sub>, glicerol a 10 mL, 10 mL de 100x 2 HPO 4 K de stock (1,5 g de K 2 HPO 4 em 10 mL de H2O), e espalhada sobre uma placa de Reis B Médio. Este é cultivada durante a noite a 28 ° C. O inoculo de bactérias é preparado por raspagem das bactérias cultivadas a partir da placa KBM em 20 mL de H2O Uma DO600 de 0,03 (~ 10 6 ufc / ml) é preparado em 1 L de tampão de inoculação (10 mM de MgCl2 + 400 uL Silwett-70). Tampão de inoculação menos bactérias foi preparado para a solução de controlo. 2. A inoculação de Tomate com Pst e H 2 O 2 histoquímica Stain Quatro semanas de idade plantas foram inoculadas por meio de imersão na solução de inoculação acima durante 30 segundos. Sacos de plástico foram colocados sobre as plantas imediatamente após a inoculação. 3'-3 'diaminobenzidina (DAB) a mancha 11 foi preparado (1 mg / ml DAB em H2O, pH 3,8 (HCl)) três days antes de usar para atingir a solubilização completa. A solução foi sacudido para misturar à temperatura ambiente. Vinte e quatro horas após o tratamento, a folha totalmente expandida foi removido, colocado em DAB mancha lado epidérmico acima, e sob vácuo infiltrada durante 15 min. As folhas foram então colocadas no escuro à temperatura ambiente durante a noite para coloração. As folhas foram fervidas em etanol a 95% durante 10 min e, em seguida mantidos em etanol a 75%. 3. Extração de Proteínas Após a colheita, as folhas do tomate foram moídos em pó fino com nitrogênio líquido utilizando almofariz e pilão. Para 0,5 g de tecido, adicionar 1,25 mL de Tris pH 8,8 tamponada de fenol e 1,25 mL / 0,5 g de tampão de extracção (0,1 M Tris-HCl pH 8,8, EDTA 10 mM, 0,9 M de sacarose), em seguida continuam de moagem para um min mais alguns num coifa. Transferir o extracto a Oakridge tubo de centrifugação (Thermo Fisher Scientific Companhia Nalgene) e agitar durante 2 horas à temperatura ambiente. Centrifugar a 5.000 xge 15 ° C durante 10 min. Transferir a fase superior fenol, para um novo tubo limpo. Back-extrair a fase aquosa com um volume igual de tampão extraído com fenol; agitar num agitador durante 30 min. Centrifugar e transferir o extracto para um tubo Falcon de novo. Repita o passo anterior mais uma vez e transferir o extrato para novo tubo Oakridge. Precipitar fenol proteínas extraídas pela adição de 5 volumes de acetato de amónio 0,1 M em metanol a 100% (armazenada a -20 ° C). Vortex e incubar à temperatura de -20 ° C durante a noite. Recolher o pelete de proteína por centrifugação a 20.000 xg, 4 ° C durante 20 min. Lavar o pellet de 2 vezes com o acetato de frio de amónio 0,1 M em metanol e 2 vezes com 80% de acetona fria. Adicionar 1,5 mL de etanol frio a 70% para sedimentar e suspender. Transferir para um tubo de microcentrífuga de 2 mL (EUA Scientific) e centrifugar a 14.000 rpm, 4 ° C durante 20 min. Remover o etanol. Seca-se a pelete brevemente num concentrador Speedvac e dissolver em uma extr proteínatampão de acção, por exemplo, Proteína ReadyPrep Reagente extraction kit 3 (8 M de ureia, CHAPS 4%, 40 mM de Tris-base, 2 M Tioureia) (Bio-Rad). Centrifugar a 14.000 rpm e 20 ° C durante 30 min para formar uma pelota. Recolher o sobrenadante. Medir a concentração de proteína usando um ensaio de proteína CB-X de acordo com o manual do fabricante (Geno Technology). 4. Preparação de Amostras e Rotulagem Peptide com cysTMTs Preparar amostra de proteína a uma concentração de 2-5 ug / uL. Aqui nós usamos 100 mg de proteína para cada marca de massa, 20 ul-50 amostras microlitro. Para esta experiência todos os 6 etiquetas foram utilizados. Adicionar volume igual de tampão de alquilação (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 200 mM de iodoacetamida) para a amostra de proteína para bloquear o grupo tiol livre. Tampão deve ser preparado fresco. A alquilação é realizado a 37 ° C durante 1 hora. Precipitar a proteína por adição de 1 ml de acetona a 80% frio a -20 ° C durante a noite. Pelete de proteína do por centrifugação a 14.000rpm, 4 ° C durante 20 min. Lavar o pellet 3 vezes com acetona a 80% vórtice de cada vez. Remover o sobrenadante e deixar secar ao ar, enquanto seca sobre gelo. Ressuspender o sedimento em 50 uL de tampão de lise (6 M de ureia, 50 mM de base Tris, 1 mM de EDTA). 0,5 ul de 100 mM de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) é então adicionado para reduzir as pontes dissulfeto por incubação durante uma hora à temperatura ambiente. Preparar etiquetas por adição de 20 uL de acetonitrilo para os tubos de reagentes para solubilizar as etiquetas. Vortex e girar para o fundo. Lavar a TCEP extra usando uma centrífuga Microcon 3KD dispositivo de filtro (Millipore). Adicionar 50 uL de amostra para Microcon coluna 3KD, e 50 uL de tampão de lise para a coluna. Centrifugar durante 15 min a 10.000 xg e 4 ° C. Repetir este passo para um total de três vezes. Remover coluna e inverter para um tubo limpo. Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 4 ° C. Verifique o pH. Se necessário, ajustar o pH a 7,0-8,0 com 1 M de HCl. Adicionar 5 uL da cysTMO reagente de T para cada amostra (O kit de reagentes cysTMT fornece 20 uL etiquetas para até 500 ug de proteína. Este método utiliza 100 ug de proteína, por conseguinte, usamos um quinto da marca.). Permitir que a reacção prosseguir durante 2 horas à temperatura ambiente. As amostras foram combinadas com Tampão de amostra Laemmli (Bio-Rad) em uma razão de 1:1. 5. A remoção de não-fracionamento da amostra reagiu Tag As amostras foram fervidas durante 5 min e separados num gel de poliacrilamida pré-fundido 12% (Bio-Rad). O gel foi lavado três vezes em intervalos de 5 minutos com filtrada H2O e coradas com Azul de Coomassie (Bio-Rad) durante 1 hora. O gel foi corado de-dia para o outro com H2O Doze frações foram coletadas de cada pista gel. As fracções foram determinados por concentrações banda de proteína. As fracções foram cortadas em pedaços de 1 mm e recolhido num tubo de 1,5 ml. Pedaços de gel foram coradas utilizando de-acetonitrilo 50% e 0,1 M de bicarbonato de amónio em H 2 </sub> O. Este passo deve ser repetido até que a cor azul é removido a partir de pedaços de gel (~ de 3-4 vezes, 15 min de cada vez). Peças de-gel corado foram secos usando acetonitrilo a 100% (cobrir pedaços de gel) durante 15 min, o sobrenadante removido, e os pedaços secos usando um Speedvac. Dissolve-se tripsina (Promega) a 1:10 (tripsina: proteína) ratio no mesmo volume (como amostras combinadas rotulada) de bicarbonato de amónio 25 mM. Por exemplo, 600 ug de proteína da amostra com um volume de 500 uL precisa 60 ug de tripsina dissolvido em 500 uL de 25 mM de bicarbonato de amónio. Adicionar a solução de tripsina para os pedaços de gel e definir em gelo para re-hidratar. Se as peças não estão cobertas adicionar 50 mM de tampão de bicarbonato de amónio. Depois de re-hidratação, incubar a 37 ° C durante 12-16 hr. Remover o extracto de proteína de líquido a partir das amostras incubadas. Parar a reacção e remover qualquer digerir a proteína restante cobrindo pedaços de gel com 5% de ácido fórmico, acetonitrilo 50% .. Agitar pedaços de gel durante 20 min a sala de TEmperature. Transferir o sobrenadante para os tubos de amostra extraída de proteína a partir de 5,7. Repita o procedimento de extração duas vezes. Seca-se os péptidos extraídos utilizando o Speedvac. 6. Enriquecimento amostra de cysTMT rotuladas de peptídeos Adicionar um gradiente de anti-TMT resina para tubos de 0,5 ml para uma lama de 50%. (Gradiente foi determinada a partir da concentração banda em gel de fraccionamento. Se uma recolha de fracções consiste de uma banda escura, mais resina é necessária. As fracções com bandas mais fracas requerem menos resina como há menos proteína.) A resina é então lavada três vezes com um volume de coluna de Tris-1x solução salina tamponada com (TBS) (25 mM de Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,2) (Thermo Scientific Pierce Research Products de proteína). Adicionar 200 uL 1xTBS para cada amostra. As amostras são então adicionados aos anti-TMT resina (Thermo Scientific Pierce Research Products de proteína) e agitado à temperatura ambiente durante 2 hr seguido por balançar durante a noite a 4 ° C. Adicionar amostra a coluna (ARMO Scientific Protein Pierce Produtos de Pesquisa). Lava-se cada coluna três vezes com TBS 1x 200 uL. Esta é seguida com lavagem três vezes com CHAPS 0,05% (dissolvido em 1x TBS). A coluna é então lavada três vezes com 4 M ureia em 1x TBS. Duzentos microlitros de H2O é então usada para lavar a coluna três vezes. Cada amostra é eluída três vezes com 200 uL de tampão de eluição de 50% (acetonitrilo a 50%, TFA a 0,4%). As amostras são então secas num concentrador de vácuo. 7. Por espectrometria de massas Ressuspender as amostras em 12 uL de acetonitrilo 3% com 0,1% de ácido fórmico e injectar 5 uL directamente sobre uma coluna de pressão elevada Eksigent nanoLC-1D cromatografia líquida (AB SCIEX, EUA). Os péptidos serão separados sobre uma coluna C18 Proteopep ID iM II 75 x 20 cm (Novo Objectivo, EUA) utilizando um gradiente de 4-60% (A: acetonitrilo 3%, 0,1% ácido fórmico; B: acetonitrilo 97%, fórmico 0,1% ácido)em 3 mL / min ao longo de 60 min. Um Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL espectrómetro de massa foi utilizado para detectar péptidos utilizando um topo 2 x experimento 3 consistindo de uma única fase MS seguido por aquisição de 3 MS / MS espectros com fragmentação dissociação maior energia C-armadilha (HCD) seguido por 3 MS / MS com dissociação induzida por colisão (CID) para identificação de proteínas. Parâmetros neste modo foram: largura Isolamento: 3,0 m / z; energia de colisão: 50% (10% em dois passos). Peptídeos Apenas duplamente e triplamente carregadas foram selecionados para a fragmentação. Parâmetros de exclusão dinâmicos foram definido como: Repita count = 1; Duração Repeat = 60; tamanho Exclusão list = 500; Exclusão duração = 28. Os valores alvo são as seguintes: MS = 5 e 5; MS / MS (HCD) = 1 e 5. Tempo de transferência de íon foram definidos para 500 para FTMS e 300 para MS / MS (HCD). Dois microscans foram necessários para espectros HCD. 8. Buscando banco de dados e quantificação Os dados adquiridos CID e HCD eram umaanalisados: usando Thermo Scientific software Discoverer Proteome 1,2 (Thermo Scientific Pierce Produtos pesquisa de proteína) através de um fluxo de trabalho ramificada que implementou um Reporter Ion Quantizer (20 ppm de tolerância de massa de íons fragmento) para quantificar a proporção. Um segmento separado processou a MS 2 espectros através da Spectrum Selector, Normalizer Spectrum, e nós Garoupa Spectrum. Os dados foram então comparados com o motor de busca Sequest. A 20 tolerância massa ppm foi utilizado. Modificações estáticas foram definidas para o reagente cysTMT (304,18 Da) e alterações dinâmicas incluiu fosforilação e oxidação da metionina (15,99 Da). Um banco de dados personalizado para Solanum lycopersicum foi composta usando RNA de dados (com cerca de 350.000 entradas da Universidade de Harvard) 13 foi utilizado em ambos os casos. 9. Os resultados representativos Uma imagem representativa de uma folha da planta de controlo de tomate e uma folha Pseudomonas inoculado émostrada na Figura 1. Uma diferença entre o controlo tratado e folhas de Pseudomonas tratados é observada. Depois de as folhas são removidos e corados usando DAB, o processo de coloração-permite a mancha histoquímica para mostrar sinais de ROS no tecido foliar (Figura 2). Figura 2A é representativa de uma folha de controle sem coloração. Figura 2B é representativa de uma folha tratada com Pseudomonas e positiva para a coloração de H2O 2 produção. Um exemplo de saída de dados Proteome Discover de uma proteína diferencialmente redox regulada é mostrado na Figura 3. Esta proteína é um ferredoxina-1 proteína conhecida redox regulamentado 14 e tem sido demonstrado que desempenham um papel na defesa contra Pseudomonas syringae pv tomate 15. Intensidade de pico entre o controlo e as amostras inoculadas é usado para obter quantificação relativa, que mostrou alterações significativas na ferredoxem-1 regulação redox (p <0,05). Picos de alta intensidade sugerem que esta proteína é oxidado em resposta ao tratamento do patógeno. A Figura 4 é um exemplo de saída de dados Proteome Discover de uma proteína que tem regulação redox de uma proteína semelhante entre uma amostra de controlo e inoculada. Os picos de intensidade semelhante sugerem a presença de ligações dissulfureto não regulada por uma alteração do tratamento. O método vai revolucionar a forma como os cientistas a detectar redox cisteínas responsivas e dissulfetos 10. Figura 1. Uma imagem representativa de tomate inoculadas folhas com a solução de controlo (A) e Pseudomonas (B). <classe span = "pdflinebreak"> Figura 2. Uma imagem representativa de DAB coloração de tomate inoculadas folhas com a solução de controlo (A) e Pseudomonas (B). As folhas foram coradas utilizando 3'-3 'diaminobenzidina. A clorofila foi removido a partir de folhas por ebulição em etanol a 95%. A coloração escura indica a presença de H2O 2. Apenas deixa inoculado com cultura de bactérias apresentaram coloração escura. Figura 3. Um exemplo de Proteome saída de dados de Discover ferredoxina-1, diferencialmente redox proteína regulada 14. Intensidade do pico acima de cada pico é usado para a quantificação absoluta. Intensidade de pico entre o controlo e as amostras inoculadas é usadopara realizar a quantificação relativa. Figura 4. Um exemplo de saída de dados Proteome Discover de uma proteína que tem intensidade de pico semelhante entre uma amostra de controlo e inoculada. Os picos de intensidade semelhante sugerem a presença de ligações dissulfureto não regulada por uma alteração do tratamento.