Profilering Thiol Redox Proteome Met behulp van Isotope Tagging massaspectrometrie

1. Groeiende Zaailingen en voorbereiden van bacteriën Zaailingen ontkiemd in MetroMix 500 grondmengsel (BWI ​​Companies) in een groeikamer (160 umol fotonen m -2 s -1 met een fotoperiode van 8 uur licht bij 22 ° C en 16 uur donker bij 20 ° C gedurende 1 week. Relatieve vochtigheid was ingesteld op 70%. zaailingen werden besproeid met water uit de kraan als nodig is om de bodem te houden uitdroogt. Twee zaailingen van vergelijkbare grootte worden vervolgens getransplanteerd 4 "diameter potten met de MetroMix 500 bodem en gekweekt nog 3 weken in dezelfde voorwaarden als 1.1. Pseudomonas syringae (PST) is in het begin T-strepen op Kings B Medium (KBM) platen (per liter: 20 g proteosepepton, 0,1975 g MgSO 4, 1% glycerol, 1,5 g K 2 HPO 4, 18 g Agar) en geteeld voor twee dagen bij 28 ° C. Een enkele kolonie wordt verzameld, gemengd in 300μl vloeibare Kings B Medium (20 g proteosepepton, 0,1975 g MgSO 4 </sub>, 10 ml glycerol, 10 ml 100x K 2 HPO 4 voorraad (1,5 g K 2 HPO 4 op de 10 ml H 2 O), en verspreid op een Kings B Medium plaat. Dit wordt gekweekt 's nachts op 28 ° C. De bacteriën inoculum wordt bereid door het afschrapen van de gekweekte bacteriën uit de KBM plaat in 20 ml H2O Een OD 600 0,03 (~ 10 6 cfu / ml) bereid in 1 liter inoculatie buffer (10 mM MgCl2 + 400 pi Silwett-70). Inenting buffer minus bacteriën werd vervaardigd voor de beheersing oplossing. 2. Enten van tomaat met Pst en H 2 O 2 Histochemische Stain Vier weken oude planten werden geïnoculeerd door dompelen in bovenstaande inoculatie oplossing gedurende 30 seconden. Doorzichtige plastic zakken werden over de planten direct na inenting. 3'-3 'diaminobenzidine (DAB) vlek 11 werd bereid (1 mg / ml DAB in H2O, pH 3,8 (HCl)) drie degen voor gebruik om volledige solubilisatie bereiken. De oplossing werd geschud te mengen bij kamertemperatuur. Vierentwintig uur na de behandeling werd het volledig uitgevouwen blad verwijderd, geplaatst in DAB vlek epidermale omhoog en vacuum geïnfiltreerd gedurende 15 minuten. De bladeren werden vervolgens in het donker bij kamertemperatuur gedurende de nacht voor de kleuring. Bladeren werden gekookt in 95% ethanol gedurende 10 minuten en vervolgens bewaard in 75% ethanol. 3. Eiwitextractie Na de oogst, werden tomatenbladeren vermalen tot fijn poeder met vloeibare stikstof met behulp van mortier en een stamper. 0,5 g weefsel toe 1,25 ml Tris pH 8,8 gebufferde fenol en 1,25 ml / g 0,5 extractiebuffer (0,1 M Tris-HCl pH 8.8, 10 mM EDTA, 0,9 M sucrose) vervolgens verder malen een paar minuten in een zuurkast. Breng het extract om Oakridge centrifugebuis (Thermo Fisher Scientific Nalgene Company) en schud gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 5.000 xgen 15 ° C gedurende 10 minuten. Breng de top fenol fase om een ​​nieuwe schone buis. Back-extract de waterfase met een gelijk volume fenol geëxtraheerd buffer; roeren op een schudapparaat gedurende 30 minuten. Centrifugeer en dragen het extract aan een nieuwe Falcon buis. Herhaal de bovenstaande stap nog een keer en zet het extract om nieuwe Oakridge buis. Neerslaan fenol geëxtraheerd eiwitten door toevoeging van 5 volumes van 0,1 M ammoniumacetaat in 100% methanol (bewaard bij -20 ° C). Vortex en incubeer bij -20 ° C voor de overnachting. Verzamelt de eiwitpellet door centrifugeren bij 20.000 xg, 4 ° C gedurende 20 minuten. Was de pellet 2x met koude 0,1 M ammoniumacetaat in methanol en 2 maal met 80% koude aceton. Voeg 1,5 ml koud 70% ethanol aan pellet en te schorten. Breng een 2 ml microcentrifugebuisje (USA Scientific) en gecentrifugeerd bij 14.000 rpm, 4 ° C gedurende 20 minuten. Verwijder de ethanol. Droog de pellet kort in een SpeedVac concentrator en los op in een eiwit extractie buffer, bijvoorbeeld ReadyPrep eiwitextractie Kit Reagens 3 (8 M ureum, 4% CHAPS, 40 mM Tris-base, 2 M thioureum) (Bio-Rad). Centrifugeer bij 14.000 rpm en 20 ° C gedurende 30 minuten tot een pellet vormen. Gebruik de bovenstaande vloeistof. Meet de eiwitconcentratie met behulp van een CB-X eiwit assay volgens de fabrikant de handleiding (Geno Technology). 4. Monstervoorbereiding en Peptide labeling met cysTMTs Bereid proteïnemonster in een concentratie van 2-5 pg / pl. Hier gebruiken we 100 ug eiwit per massa-tag, 20 ul-50 il monsters. Voor dit experiment alle 6 labels gebruikt. Voeg gelijk volume alkylering buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 200 mM iodoacetamide) aan het proteïnemonster het vrije thiol groep geblokkeerd. Buffer moet vers worden bereid. Alkylering wordt uitgevoerd bij 37 ° C gedurende 1 uur. Neerslaan van de eiwitten door 1 ml 80% koude aceton bij -20 ° C overnacht. Pellet het eiwit door centrifugeren bij 14.000rpm, 4 ° C gedurende 20 minuten. Was de pellet 3 maal met 80% aceton telkens vortexen. Verwijder de bovenstaande vloeistof en laat het drogen terwijl de lucht op het ijs. De pellet in 50 ul lysis buffer (6 M ureum, 50 mM Tris base, 1 mM EDTA). 0,5 pi 100 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) wordt vervolgens toegevoegd aan de disulfidebindingen verminderen incuberen gedurende een uur bij kamertemperatuur. Bereid labels door toevoeging van 20 pi van acetonitril de reageerbuizen de codes solubiliseren. Vortex en draaien tot op de bodem. Spoel de extra TCEP met een Microcon 3KD centrifugaalfilter apparaat (Millipore). Voeg 50 ul monster Microcon 3KD kolom en 50 ul lysis buffer aan de kolom. Centrifugeer 15 minuten bij 10.000 xg en 4 ° C. Herhaal stap in totaal drie keer. Verwijder de kolom en omgekeerd in een schone buis. Centrifugeer 5 min bij 1000 x g en 4 ° C. Controleer de pH. Indien nodig, breng de pH op 7.0-8.0 met 1 M HCl. Voeg 5 pi de cysTMT reagens aan elk monster (De cysTMT reagens kit biedt 20 ul tags voor maximaal 500 ug eiwit. Deze methode maakt gebruik van 100 ug eiwit daarom maken we gebruik van een vijfde van de tag.). Laat de reactie doorgaan gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Monsters werden gecombineerd met Laemmli monsterbuffer (Bio-Rad) in een 1:1 verhouding. 5. Verwijdering van niet-gereageerd Tag Sample Fractionering Monsters werden gedurende 5 min gekookt en gescheiden op een geprefabriceerde 12% polyacrylamidegel (Bio-Rad). De gel werd driemaal gewassen in 5 minuut met gefilterd H2O en gekleurd met Coomassie Blue (Bio-Rad) gedurende 1 uur. De gel was de-lood 's nachts met H 2 O. Twaalf fracties werden verzameld uit elke gel baan. Fracties werden bepaald door eiwitband concentraties. Fracties werden gehakt in 1mm stukjes en verzameld in een 1,5 ml buis. Gel stukken waren de-gekleurd met 50% acetonitril en 0,1 M ammoniumbicarbonaat in H2 </sub> O. Deze stap wordt herhaald totdat blauwe kleur uit gel stukken (~ 3-4 maal, 15 min per keer). De gekleurde gel stukken werden gedroogd met 100% acetonitril (betrekking gel stuks) gedurende 15 minuten supernatant verwijderd en de stukken gedroogd met een SpeedVac. Los trypsine (Promega) op 1:10 (trypsine: eiwit) verhouding in hetzelfde volume (als samengevoegde het label monster) van 25 mM ammoniumbicarbonaat. Bijvoorbeeld, 600 ug eiwit monster met een volume van 500 ul moet 60 pg trypsine opgelost in 500 pL 25 mM ammoniumbicarbonaat. Voeg de trypsine oplossing voor de gel stukken en zet op het ijs te hydrateren. Als er stukjes vallen niet onder voeg 50 mM ammoniumbicarbonaat buffer. Na rehydratatie, incuberen bij 37 ° C gedurende 12-16 uur. Verwijder de vloeistof eiwit uittreksel uit de bebroede monsters. Stop de reactie en alle resterende eiwitten te verteren door het bedekken van gel stukken met 5% mierenzuur, 50% acetonitril .. Schudden gel stukken gedurende 20 min bij kamertemperatuur temperature. Breng de bovenstaande het geëxtraheerde eiwit monsterbuizen van 5,7. Twee keer Herhaal de extractie procedure. Droog de geëxtraheerde peptiden met de SpeedVac. 6. Voorbeeld Verrijking van cysTMT Labeled-peptiden Voeg een gradiënt van anti-TMT hars tot 0,5 ml buizen voor een 50% slurry. (Gradient werd bepaald uit band concentratie fractionering gel. Als een verzameling van fracties uit een donkere band, meer hars nodig. Fracties met een zwakkere band vereisen minder hars is minder eiwit.) De hars wordt vervolgens driemaal gewassen met een kolom volume van 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) (25 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,2) (Pierce Thermo Scientific Eiwitten Products). Voeg 200 ul 1xTBS aan elk monster. Monsters worden vervolgens toegevoegd aan anti-TMT hars (Thermo Scientific Pierce Eiwitten Products) en geroerd bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, gevolgd door tuimelen overnacht bij 4 ° C. Voeg monster kolom (TheRMO Wetenschappelijk Pierce Protein Research Products). Was elke kolom drie keer met 1x 200 pi TBS. Dit wordt dan gevolgd door driemaal wassen met 0,05% CHAPS (opgelost in 1x TBS). De kolom wordt dan drie keer gewassen met 4 M ureum 1x TBS. Tweehonderd microliter H2O wordt gebruikt om de kolom driemaal wassen. Elk monster wordt driemaal uitgewassen met 200 pi 50 elutiebuffer% (50% acetonitril, 0,4% TFA). Monsters worden vervolgens gedroogd in een vacuum concentrator. 7. Massaspectrometrie Analyse Resuspenderen de monsters in 12 pl 3% acetonitril met 0,1% mierezuur en direct injecteren 5 pi op een Eksigent nanoLC-1D hogedrukvloeistofchromatografie kolom (AB Sciex, USA). Peptiden worden afgescheiden in een Proteopep II C18 kolom 75 urn ID x 20 cm (New Objective, USA) met een 4-60% gradiënt (A: 3% acetonitril, 0,1% mierezuur, B: 97% acetonitril, 0,1% mierezuur zuur)bij 3 pl / min 60 min. Een Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL massaspectrometer werd gebruikt om peptiden met een top 2 te detecteren x 3 experiment bestaande uit enkele fase MS gevolgd door de aankoop van 3 MS / MS spectra met een hogere energie-C-trap dissociatie (HCD) fragmentatie, gevolgd door 3 MS / MS met een botsing geïnduceerde dissociatie (CID) voor eiwit identificatie. Parameters in deze modus zijn: Isolatie breedte: 3,0 m / z; Collision energie: 50% (10% met twee stappen). Alleen dubbel-en driedubbel geladen peptiden werden geselecteerd voor fragmentatie. Dynamische uitsluiting parameters werden ingesteld op: Herhaal tellen = 1; Herhaal Duur = 60; Uitsluiting lijst size = 500; Uitsluiting duur = 28. Doel waarden zijn: MS = 5 e 5, MS / MS (HCD) = 1 e 5. Ion overdracht tijden werden ingesteld op 500 voor FTMS en 300 voor MS / MS (HCD). Twee microscans nodig waren voor HCD spectra. 8. Database te doorzoeken en Kwantificering De verworven CID en de HCD data waren eennalyzed met behulp van Thermo Scientific Proteome Discoverer software 1.2 (Thermo Scientific Pierce Protein Research Products) via een vertakte workflow die een verslaggever Ion kwantiseerder (20 ppm massa tolerantie van fragment ionen) geïmplementeerd om de verhouding te kwantificeren. Een apart segment verwerkt de MS 2 spectra door de Spectrum Selector, Spectrum Normalizer, en Spectrum Grouper knooppunten. De gegevens werden vervolgens doorzocht tegen de Sequest zoekmachine. Een 20 ppm massa tolerantie werd gebruikt. Statische wijzigingen werden gesteld om de cysTMT reagens (304.18 Da) en dynamische wijzigingen opgenomen fosforylering en methionine oxidatie (15.99 Da). Een op maat database voor Solanum lycopersicum was samengesteld met behulp van RNA-gegevens (met ongeveer 350.000 inzendingen uit Harvard University) 13 werd gebruikt in beide gevallen. 9. Representatieve resultaten Een representatief beeld van een controle tomatenplant blad en een Pseudomonas ingeënt bladfiguur 1. Een verschil tussen de behandelde-controle en Pseudomonas behandelde bladeren wordt waargenomen. Nadat de bladeren zijn verwijderd en gekleurd met DAB de de-kleuring werkwijze maakt de histochemische vlek vertonen ROS in het plantenweefsel (figuur 2). Figuur 2A is representatief voor een controle blad zonder vlekken. Figuur 2B is representatief van een blad behandeld met Pseudomonas positieve kleuring voor H 2 O 2 productie. Een voorbeeld van Proteome Discover datauitgang van een differentieel redox gereguleerd proteïne is in figuur 3. Dit eiwit is een bekend redox gereguleerde eiwit ferredoxin-1 14 en is aangetoond dat een rol afweer tegen Pseudomonas syringae pv tomaat 15. Peak intensiteit tussen controle en ingeënt monsters wordt gebruikt om de relatieve kwantificatie, die aanzienlijke wijzigingen in ferredox toonde te verkrijgenin een redox regeling (p <0,05). Hoge intensiteit pieken suggereren dat dit eiwit wordt geoxideerd in reactie op de behandeling pathogeen. Figuur 4 een voorbeeld van Proteome Discover datauitgang van een eiwit dat soortgelijke redox regeling van een eiwit van een controle-en geïnoculeerd monster. Pieken van vergelijkbare intensiteit suggereren de aanwezigheid van disulfidebindingen niet door een verandering in de behandeling. De methode verandert de manier waarop wetenschappers redox reageren cysteines en disulfiden 10 op te sporen. Figuur 1. Een representatief beeld van geënt tomatenbladeren met controle-oplossing (A) en Pseudomonas (B). <span class = "pdflinebreak"> Figuur 2. Een representatief beeld van DAB kleuring van geënt tomatenbladeren met controle-oplossing (A) en Pseudomonas (B). Bladeren werden gekleurd met 3'-3 'diaminobenzidine. Chlorofyl werd uit bladeren door koken in 95% ethanol. Donkere plekken de aanwezigheid van H 2 O 2. Alleen laat geënt met bacteriën cultuur toonde donkere vlekken. Figuur 3. Een voorbeeld van Proteome Discover datauitgang van ferredoxin-1, differentieel redox gereguleerd proteïne 14. Peak intensiteit boven elke piek wordt gebruikt voor absolute kwantificering. Piekintensiteit tussen controle en geënt samples gebruiktrelatieve kwantificering uitgevoerd. Figuur 4. Een voorbeeld van Proteome Discover datauitgang van een eiwit dat soortgelijke piekintensiteit tussen controle en geïnoculeerd monster. Pieken van vergelijkbare intensiteit suggereren de aanwezigheid van disulfidebindingen niet door een verandering in de behandeling.