التنميط بروتيوم الأكسدة والاختزال ثيول استخدام الطيف النظائر كتلة توصيف
Summary
ورفع مستوى رد الفعل أنواع الاكسجين عندما تواجه الخلايا ظروف الإجهاد. هنا نعرض على سبيل المثال من تلطيخ diaminobenzidine 3'-3 "فضلا عن cysTMT وضع العلامات وقياس الطيف الكتلي لمحة عن بروتيوم الأكسدة في<em> الزائفة syringae</em> تعامل أوراق الطماطم.
Abstract
الزائفة syringae الكهروضوئية DC3000 السلالة. الطماطم ليس فقط يسبب مرض جرثومي بقعة في lycopersicum مغد ولكن أيضا على أنواع الكرنب، وكذلك على thaliana Arabidopsis، وهو نبات المضيف لين العريكة وراثيا 1،2. تراكم أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) في النبتات تلقيح مع DC3000 يشير إلى وجود دور للروس في تحوير موت الخلايا نخرية خلال مرض جرثومي بقعة من الطماطم 3. ويتم إنتاج بيروكسيد الهيدروجين، وهو مكون من روس، بعد تلقيح نباتات الطماطم مع الزائفة 3. ويمكن الكشف عن بيروكسيد الهيدروجين باستخدام وصمة عار 3'-3 النسيجية "diaminobenzidine (DAB) 4. DAB تلطيخ يتفاعل مع بيروكسيد الهيدروجين لإنتاج البني وصمة عار على ورقة 4 الأنسجة. ROS بدور تنظيمي للبيئة الأكسدة الخلوية، والتي يمكن تغيير حالة الأكسدة من بروتينات معينة 5. السيستين هو حمض أميني مهم حساسة للالأكسدة التغييرات. تحت أكسدة خفيفة، وأكسدة عكسها الجماعات السيستين سلفهيدريل بمثابة المجسات الأكسدة ومحولات الطاقة إشارة إلى أن تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات الفيزيولوجية 6،7. جنبا إلى جنب كتلة علامة (TMT) الكواشف تمكين المتزامنة وتحديد الكميات المضاعفة من البروتينات في عينات مختلفة باستخدام جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي 8،9. والسيستين التفاعل TMT (cysTMT) الكواشف تمكين وضع العلامات انتقائية والكميات النسبية للالسيستين التي تحتوي على الببتيدات من ما يصل الى ستة العينات البيولوجية. كل علامة cysTMT إسوي الضغط له نفس كتلة الأم الاسمي، وتتكون من مجموعة سلفهيدريل التفاعل، وهي ذراع هل MS-محايدة وافاد مراسل MS / MS 10. بعد وضع العلامات، وكانت العينات التي تخضع لعملية الهضم البروتيني. وقد أثرى الببتيدات السيستين المسمى باستخدام الراتنج التي تحتوي على المضادة للTMT الأجسام المضادة. خلال MS / MS تحليل، سلسلة من الأيونات مراسل (أي 126-131 دا) تنشأ في المنطقة كتلة منخفضة، وتوفير المعلومات عن الكميات النسبية.سير العمل غير فعالة للحد من تعقيد العينة، وتحسين المدى الديناميكي ودراسة التعديلات السيستين. هنا نقدم تحليل البروتين الأكسدة من الطماطم DC3000 الباسيفيكي المعالجة (ريو غراندي) يترك باستخدام تكنولوجيا cysTMT. هذا أسلوب الإنتاجية العالية لديه القدرة على أن تطبق على دراسة أخرى الأكسدة التنظيم العمليات الفيزيولوجية.
Protocol
Discussion
هذا البروتوكول يوفر معلومات عن أداء تلطيخ DAB، فضلا عن cysTMT المسمى الكمي السيستين الأكسدة. هذه الإجراءات هي مفيدة في دراسة إنتاج ريوس، فضلا عن تأثير ذلك على تنظيم البروتينات عندما يتم تلقيح مغد lycopersicum مع syringae الزائفة. الطرق الواردة في هذا البروتوكول توفير وسيلة لفحص عينات ريوس في ورقة كاملة في الطريقة التي تسبب أقل قدر من الضرر على الأنسجة ورقة. الإجراء وضع العلامات يوفر وسيلة لفحص الأكسدة يحتمل البروتينات تنظم من خلال استخدام أسلوب وضع العلامات السيستين. هذا مفيد عند النظر في مرحلة مبكرة من الاستجابة للضغط النفسي.
ويمكن استخدام أساليب مثل علامة تقارب النظائر تلوينها (ICAT) وcysTMT في دراسة إمكانية تنظيم الأكسدة البروتينات في عينات بيولوجية. ICAT يسمح وضع العلامات والمقارنة بين عينتين 12. كلا أساليب تسمية cysteines حرة ويمكن استخدامها لبروتين quantificأوجه 10،12. ومع ذلك، فإن طريقة cysTMT يسمح للانخفاض في اختلاف التجارب وكذلك الإرسال المتعدد 10. عدد العلامات المتاحة يسمح للباحثين لتشمل مكررات أو عينات متعددة في تصميمها التجريبية. وجود المزيد من عينات يوفر احتمال وجود عدد أكبر من البروتينات التي تم تحديدها. ومن المآخذ الرئيسية لتقنية cysTMT هو أنه ينال من الجودة الشاملة لتحديد بروتين بسبب الخطوات تخصيب انتقائية لcysTMT المسمى-الببتيدات (6،5-6،6). عدد الببتيدات لتحديد بروتين يعتمد بشكل كبير على عدد من بقايا السيستين في تسلسل البروتين. ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق تقديم جزء من العينة تريبسيني قبل التخصيب لقياس الطيف الكتلي تحديد بروتين.
نظرا لطبيعة التصميم التجريبي، وكذلك آلية وضع العلامات التي تستخدم أسلوب cysTMT، خطوات معينة حاسمة. أثناء أداء preci بروتينpitation وبيليه الغسيل (3.9) من المهم للحفاظ على عينات من الفتور على الجليد للحد من تدهور البروتين. خلال وضع العلامات cysTMT، إزالة كاشف الحد من (4.6) مهم جدا لأنه قد يتعرض لوضع العلامات عينات عكس ذلك. وضع العلامات العكس هو ممكن إذا خفض كاشف لا يزال في العينة. إذا خفضت عينات بعد وضع العلامات، يمكن إزالة العلامة cysTMT. مرة واحدة يتم إضافة تسميات للعينات، لا بد من التحقق من مستوى الرقم الهيدروجيني (4.7) من أجل الحصول على أفضل كفاءة وضع العلامات. وبالإضافة إلى ذلك، وتحليل البيانات تعتمد على ما هو مطلوب من الباحث والهدف النهائي في استخدام بروتوكول. كما أنها تعتمد على البرمجيات المستخدمة في كل برنامج لديه خوارزميات مختلفة.
هذه التجربة تستخدم الممرض بوصفه elicitor لزيادة الإنتاج من الأنواع المؤكسدة رد الفعل في الطماطم، ومع ذلك، يمكن قياس غيرها من الاستجابات للوائح الأكسدة وفقا لذلك. هذا التصميم التجريبي غير قابلة للتكيف مع النباتية الأخرى والنظم الحيوانية. </P>
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور غريغ مارتن (جامعة كورنيل) وجماعته لتوفير سلالة DC3000، وبذور الطماطم، وتقديم المشورة. وهم يودون أيضا أن أشكر الدكتور تشونغ لين مذكرة تفاهم للمساعدة في بروتوكول DAB وشعبة البروتيوميات في مركز الجبهة المتحدة المتعدد التخصصات للبحوث التكنولوجيا الحيوية للحصول على المساعدة في تطوير أسلوب. تم تعديل بروتوكول لاستخراج البروتين من Hurkman وتاناكا 16. تم تعديل بروتوكول بشأن وضع العلامات cysTMT، الخطوات من 4 إلى 6 على أساس المنتج الأصلي بيرس الحرارية العلمية فيشر دليل 17. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (MCB 0818051 لتشن S).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| MetroMix 500 | BWI Companies | TX-500 |
| 3,3′-Diaminobenzidine | Sigma-Aldrich | D8001 |
| ReadyPrep Sequential Extraction kit Reagent 3 | Bio-Rad | 163-2104 |
| CB-X protein assay | Geno Technology | 786-12x |
| cysTMT reagents | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90071 |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 |
| Bio-Safe Comassie (G-250 stain) | Bio-Rad | 161-0786 |
| Microcon 3KD column | Millipore | 42403 |
| Immobilized Anti-TMT resin | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90076 |
| Centrifuge column | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 89896 |
| Proteopep II C18 column | New Objective | PFC7515-PP2-10 |
| NanoLC-1D HPLC | AB Sciex | 90389 |
| LTQ Orbitrap XL | Thermo Scientific | 0020137580 |
| SpeedVac | Labconco | 7812013 |
| Proteome Discoverer 1.2 software | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | |
| Trypsin | Promega | V5111 |
| Oakridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific Nalgene Company | 3139-0050 |
| Microcentrifuge tube (2ml) | USA Scientific | 1620-2700 |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 |
| Top of Form >Bio-Safe Coomassie StainBottom of Form |
Bio-Rad | 161-0786 |
| TMT enrichment kit | Thermo Scientific Pierce Protein Research Products | 90077 |
References
- Almeida, N. F. A draft genome sequence of Pseudomonas syringae pv. tomato T1 reveals a type III effector repertoire significantly divergent from that of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Mol. Plant Microbe Interact. 22, 52-62 (2009).
- Preiter, K. Novel virulence gene of Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000. J. Bacteriol. 187, 7805-7814 (2005).
- Apostol, I., Heinstein, P. F., Low, P. S. Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells: role in defense and signal transduction. Plant Physiol. 90, 109-116 (1989).
- Orozco-Cardenas, M., Ryan, C. A. Hydrogen peroxide is generated systemically in plant leaves by wounding and systemin via the octadecanoid pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6553-6557 (1999).
- Tonks, N. K. Redox redux: revisiting PTPs and the control of cell signaling. Cell. 121, 667-670 (2005).
- Alvarez, S., Wilson, G. H., Chen, S. Determination of in vivo disulfide-bonded proteins in Arabidopsis. J. Chromatogr. B. 877, 101-104 (2009).
- Apel, K., Hirt, H. Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annu. Rev. Plant Biol. 55, 373-399 (2004).
- Dayon, L. Relative quantification of proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6- plex isobaric tags. Anal. Chem. 80, 2921-2931 (2008).
- Thompson, A. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75, 1895-1904 (2003).
- Rosenblatt, M. A novel cysteine-reactive tandem mass tag reagent for subproteome labeling, enrichment and quantitation. , TP169 (2010).
- Clark, J. Phenotypic analysis of Arabidopsis mutants: diaminobenzidine stain for hydrogen peroxide. Cold Spring Harb. Protoc. , (2009).
- Sethuraman, M. Isotope-Coded affinity tag (ICAT) approach to redox proteomics: identification and quantification of oxidant-sensitive cysteine thiols in complex protein mixtures. J. Proteome Res. 3, 1228-1233 (2004).
- Asso, M. EPR and redox characterization of ferredoxins I and II from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki. Biochem. Biophys. Res. Commun. 211, 198-204 (1995).
- Huang, H. e. Disease resistance to bacterial pathogens affected by the amount of ferredoxin-I proteins in plants. Mol. Plant Pathol. 8, 129-137 (2007).
- Hurkman, W., Tanaka, C. Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis. Plant Physiol. 81, 802-806 (1986).
