Профилирование тиоловых Редокс Протеом Использование изотопной масс-спектрометрии тегов

1. Выращивания рассады и подготовки бактерии Рассаду проращивают в Metromix 500 почвенную смесь (BWI ​​компаний) в ростовой камере (160 мкмоль квантов м -2 с -1 с фотопериода 8 часов света при 22 ° С и 16 часов темно при 20 ° С в течение 1 недели. Относительная влажность была установлена ​​на 70%. Рассада поливали водой из-под крана, как необходимые для поддержания почвы становится сухой. Два саженцев такого же размера, которые затем пересаживают на 4 ", диаметр кастрюли с Metromix 500 почве и выросли еще на 3 недели в тех же условиях 1.1. Pseudomonas syringae (Pst) изначально Т-прожилками на Kings В Средние (КБМ) пластин (за литр: 20 г протеоза пептон, 0,1975 г MgSO 4, 1% глицерина, 1,5 г K 2 HPO 4, 18 г агар) и вырос на Два дня при 28 ° C. Единственная колония собирается, смешивается с 300 мкл жидкости Kings В средней (20 г протеоза пептон, 0,1975 г MgSO 4 </suб>, 10 мл глицерина, 10 мл 100x K 2 HPO 4 акции (1,5 г K 2 HPO 4 в 10 мл H 2 O), а также распространение на Kings В средней пластине. Это культивировали в течение ночи при 28 ° C. Бактерии посевной подготовлено выскабливание культурный бактерий из КБМ пластины в 20 мл H 2 O. OD 600 0,03 (~ 10 6 КОЕ / мл) готовится в 1 л буфера прививки (10 мМ MgCl 2 + 400 мкл Silwett-70). Прививка буфера минус бактерий подготовленные для управления решением. 2. Прививка томатов с Pst и H 2 O 2 гистохимические пятен Четыре недели старых заводов были привиты путем погружения в раствор выше прививки в течение 30 секунд. Прозрачных пластиковых пакетах были поставлены на растения сразу же после прививки. 3'-3 'диаминобензидина (DAB) пятно 11 был подготовлен (1 мг / мл DAB в H 2 O, рН 3,8 (HCl)) три гн я, прежде чем использовать, чтобы достичь полного растворения. Решение потрясли перемешать при комнатной температуре. Двадцать четыре часа после лечения, полностью построенного лист был удален, помещенная в DAB пятно эпидермальный стороной вверх, и вакуум проникли в течение 15 мин. Листья затем положить в темноте при комнатной температуре в течение ночи для окрашивания. Листья варят в 95% этаноле в течение 10 минут, а затем хранить в 75% этаноле. 3. Добыча белки После сбора урожая помидор листья измельчают в порошок с жидким азотом использованием ступки и пестика. За 0,5 г ткани, добавить 1,25 мл трис рН 8,8 буфере фенола и 1,25 мл / 0,5 г экстракционного буфера (0,1 М Трис-HCl рН 8,8, 10 мМ ЭДТА, 0,9 М сахарозы), а затем продолжить измельчение на несколько минут в вытяжной шкаф. Передача экстракт Oakridge центрифуге трубки (Thermo Fisher Scientific Nalgene компании) и перемешивать в течение 2 часов при комнатной температуре. Центрифуга на 5000 мкги 15 ° С в течение 10 мин. Передача верхней фенольной фазы в новую чистую пробирку. Back-извлечь водной фазы с равным объемом фенола извлечены буфера; агитировать на шейкере в течение 30 мин. Центрифуга и передать выписки в новую пробирку Falcon. Повторите предыдущий шаг еще раз, и передать экстракт трубы нового Oakridge. Ускорить фенола извлечения белков, добавив 5 объемов 0,1 М ацетата аммония в 100% метанола (хранить при температуре -20 ° С). Vortex и инкубировать при температуре -20 ° С в течение ночи. Сбор белка гранул путем центрифугирования при 20000 х г, 4 ° С в течение 20 мин. Промойте осадок в 2 раза с холодным аммония 0,1 М ацетата в метаноле и 2 раза с 80% холодного ацетона. Добавить 1,5 мл холодного 70% этанола для осаждения и приостановить. Трансфер в 2 мл микроцентрифужных трубки (США Scientific) и центрифуги при 14000 оборотах в минуту, 4 ° С в течение 20 мин. Удалить этанола. Высушите кратко гранул в SpeedVac концентратора и раствориться в белке дрождействия буфера, например, белка ReadyPrep Добыча набор реагентов 3 (8 М мочевины, 4% CHAPS, 40 мМ Трис-основание, 2 М тиомочевины) (Bio-Rad). Центрифуга при 14000 оборотах в минуту и ​​20 ° C в течение 30 минут, чтобы сформировать шарик. Соберите супернатант. Измерение концентрации белка использованием CB-X белка анализа в соответствии с инструкцией завода-изготовителя (Гено технологии). 4. Подготовка проб и пептидов маркировки с cysTMTs Подготовить образец белка в концентрации 2-5 мкг / мкл. Здесь мы используем 100 мкг белка для каждой массы теги, 20 мкл, 50 мкл образца. Для этого эксперимента все 6 метки были использованы. Добавить равный объем алкилирования буфера (100 мМ Трис-HCl pH7.5, 200 мм iodoacetamide) с белком образец для блокирования свободных тиоловых групп. Буфер должен быть готов свежий. Алкилирование проводят при температуре 37 ° С в течение 1 часа. Осаждения белков путем добавления 1 мл холодного 80% ацетона при -20 ° C на ночь. Гранул белка центрифугированием при 14000оборотов в минуту, 4 ° С в течение 20 мин. Промойте осадок в 3 раза с 80% ацетона встряхивая каждый раз. Удалить супернатант и дайте высохнуть на воздухе в то время как на льду. Ресуспендируют гранул в 50 мкл буфера для лизиса (6 М мочевина, 50 мМ Трис базы, 1 мМ ЭДТА). 0,5 мкл 100 мМ Трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP) добавляется для уменьшения дисульфидных связей путем инкубирования в течение одного часа при комнатной температуре. Подготовить теги, добавив 20 мкл ацетонитрила реагента труб для растворения тегов. Vortex и спина вниз. Промыть дополнительных TCEP помощью микроконтроллер 3KD центробежный фильтр устройства (Millipore). Добавить 50 мкл образца колонку микроконтроллер 3KD и 50 мкл буфера для лизиса к колонке. Центрифуга в течение 15 мин при 10000 х г и 4 ° C. Повторите этот шаг для всего три раза. Удалить столбец и инвертировать в чистую пробирку. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 мкг и 4 ° C. Проверьте рН. При необходимости, отрегулировать рН до 7,0-8,0 с 1 M HCl. Добавьте 5 мкл cysTMT реагент для каждого образца (cysTMT набор реагентов обеспечивает 20 мкл теги до 500 мкг белка. Этот метод использует 100 мкг белка, поэтому мы используем одну пятую часть тега.). Позвольте протекания реакции в течение 2 часов при комнатной температуре. Образцы вместе с Laemmli Пример буфера (Bio-Rad) в соотношении 1:1. 5. Удаление непрореагировавшего фракционирования образцов тегов Образцы кипятят 5 минут и разделены на сборных 12% полиакриламидном геле (Bio-Rad). Гель промывали три раза в 5-минутными интервалами с фильтром H 2 O и окрашивали Кумасси синий (Bio-Rad) в течение 1 часа. Гель-де-окрашенных ночь с H 2 O. Двенадцать фракции собирали с каждого геля переулке. Фракции определяется концентрацией белков группы. Фракции нарезанного на кусочки 1 мм и собирается в 1,5 мл трубки. Гель части были де-окрашенных с использованием 50% ацетонитрила и 0,1 М бикарбонат аммония в H 2 </SUB> О. Этот шаг следует повторять, пока синий цвет удаляется из геля штук (~ 3-4 раза, 15 минут каждый раз). Де-окрашенных частей гель сушили с использованием 100% ацетонитрила (покрытие гелем штук) в течение 15 мин, супернатант удаляют, и части сушат SpeedVac. Растворите трипсина (Promega) в 1:10 (трипсин: белок) соотношение в том же объеме (как объединенные надписью образец) от 25 мМ бикарбоната аммония. Например, 600 мкг белка образец объемом 500 мкл необходимо 60 мкг трипсина растворяли в 500 мкл 25 мМ бикарбоната аммония. Добавить раствора трипсина в гель кусочки и установить на льду увлажняет. Если части не распространяются добавить 50 мМ бикарбоната аммония буфера. После регидратации, инкубировать при 37 ° С в течение 12-16 часов. Удалить жидкий экстракт белка из инкубационных образцов. Остановить реакцию и удалить все оставшиеся дайджест белка покрытие части геля с 5% муравьиной кислоты, 50% ацетонитрила .. Встряхнуть гель частей в течение 20 мин при комнатной теmperature. Перенести супернатант для извлечения труб белков выборки из 5.7. Повторите процедуру извлечения в два раза. Высушите извлеченного пептидов использованием SpeedVac. 6. Пример Обогащение cysTMT Маркированный-пептидов Добавить градиент анти-TMT смолы до 0,5 мл пробирок на 50% раствора. (Градиент определяется из группы концентрация в фракционирования гель. Если часть коллекции состоит из темной полосы, больше смол не требуется. Фракций с более слабых полос требуют меньше смолы, как есть меньше белка). Смолу затем промывают три раза с одного столбца объем 1x Трис-буферного раствора (TBS) (25 мМ Трис, 0,15 М NaCl, рН 7,2) (Thermo Scientific Пирс Продукты белка РАН). Добавить 200 мкл 1xTBS для каждого образца. Образцы затем добавил к анти-TMT смолы (Thermo Scientific Пирс Продукты белка РАН) и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов следует покачиваясь на ночь при 4 ° C. Добавить образца колонку (РМО научно Пирс белка РАН продукты). Промыть каждую колонку в три раза с 1x 200 мкл TBS. Это то следует со стиральной три раза с 0,05% CHAPS (растворяется в 1x TBS). Затем колонку промывают три раза с 4 М мочевины в 1x TBS. Двести мкл H 2 O используется для мытья колонки в три раза. Каждый образец вымывается в три раза с 200 мкл 50% элюирующего буфера (50% ацетонитрила, 0,4% TFA). Образцы затем высушивают в вакууме концентратора. 7. Масс-спектрометрический анализ Ресуспендируйте образцов в 12 мкл 3% ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислоты и вводят 5 мкл непосредственно на Eksigent NanoLC-1D высокое давление жидкости хроматографии (AB Sciex, США). Пептиды будут разделены на Proteopep II C18 колонка 75 мкм ID х 20 см (Новая цель, США) с использованием 4-60% градиент (3% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты; B: 97% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислота)в 3 мкл / мин в течение 60 мин. Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL масс-спектрометр был использован для обнаружения пептидов помощью верхней 2 х 3 эксперимент, состоящий из одной стадии MS последующим приобретением в 3 MS / MS спектры с более высокой энергией C-ловушка диссоциации (HCD) фрагментация затем 3 MS / МС с столкновение индуцированное диссоциации (CID) для идентификации белков. Параметры в этом режиме были: изоляция ширина: 3,0 м / г, энергия столкновения: 50% (10% в два этапа). Только дважды и трижды заряженные пептиды были отобраны для фрагментации. Динамические параметры исключения были установлены в: Повторите count = 1; повтор Продолжительность = 60; списка исключений размер = 500; Исключение длительность = 28. Целевые показатели таковы: MS = 5 ^ 5, MS / MS (HCD) = 1 ^ 5. Раз Ион передачи были установлены в 500 FTMS и 300 для MS / MS (HCD). Два microscans были необходимы для HCD спектров. 8. Поиск баз данных и количественный Полученные CID и HCD данные былиnalyzed использовании Thermo Scientific Протеом Discoverer программного обеспечения 1.2 (Thermo Scientific Пирс Продукты белка РАН), через разветвленную рабочий процесс в котором реализована Reporter Ион Quantizer (20 страниц в минуту массовый допуск осколочных ионов) в количественном соотношении. Отдельный сегмент обрабатывается MS 2 спектры через спектра выбора, Спектр Normalizer и узлы спектра окунь. Данные были затем искали в отношении поисковой SEQUEST. 20 страниц в минуту массовый допуск был использован. Статические модификации были установлены в cysTMT реагента (304,18 Da) и динамические изменения, внесенные фосфорилирования и окисления метионина (15,99 Da). Пользовательской базы данных для Solanum Lycopersicum была составлена ​​с помощью РНК данных (около 350 000 записей из Гарвардского университета) 13 был использован в обоих случаях. 9. Представитель Результаты Представитель образ управления производством листьев томата и Pseudomonas привиты листпоказано на рисунке 1. Разница между контролем лечение и лечение Pseudomonas листьев наблюдается. После того, как листья удаляют и окрашивали DAB, де-окрашивание процесс позволяет гистохимических пятно проявлять признаки АФК в ткани листа (рис. 2). Рисунок 2А представитель управления лист, не окрашивания. Рисунок 2B является представителем листа относились с Pseudomonas и положительное окрашивание для Н 2 О 2. Пример Протеом Discover выходных данных дифференциально окислительно-восстановительных регулируется белком показано на рисунке 3. Этот белок является известным окислительно-восстановительных регулируемых ферредоксин-1 белок 14 и было показано, играют важную роль в обороне против Pseudomonas syringae ру томатный 15. Пик интенсивности между контролем и привитых образцов используется для получения относительного количественного, который показал значительные изменения в ferredoxв-1, окислительно-восстановительные регулирования (р <0,05). Высокие пики интенсивности показывают, что этот белок окисляется в ответ на возбудителя лечение. На рисунке 4 приведен пример Протеом Discover выход данных белок, который имеет аналогичные редокс регуляции белков между контролем и привиты образца. Пики подобных интенсивности предполагают наличие дисульфидных связей не регулируется изменением в лечении. Метод революцию, как ученые обнаружить окислительно-восстановительных реагировать цистеина и дисульфиды 10. Рисунок 1. Репрезентативную картину привиты помидор листья с контрольным раствором (А) и Pseudomonas (B). <диапазон класс = "pdflinebreak"> Рисунок 2. Представителю образ DAB окрашивания привиты помидор листья с контрольным раствором (А) и Pseudomonas (B). Листья окрашивают использованием 3'-3 'диаминобензидина. Хлорофилл был удален из листьев при кипячении в 95% этаноле. Темная окраска указывает на наличие H 2 O 2. Только оставляет засевают культуру бактерий показал, темное окрашивание. Рисунок 3. Пример Протеом Discover выход данных ферредоксин-1, дифференциально окислительно-восстановительных регулируется белком 14. Пик интенсивности над каждым пиком используется для абсолютного количественного. Пик интенсивности между контролем и привитых образцов использовалисьвыполнять относительные количества. Рисунок 4. Пример Протеом Discover выход данных белок, который имеет такие же пик интенсивности между контролем и привиты образца. Пики подобных интенсивности предполагают наличие дисульфидных связей не регулируется изменением в лечении.