פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

1. גידול שתילים וחיידקים הכנת השתילים הם מונבטים בתערובת 500 אדמה MetroMix (חברות BWI) בתא הגידול (160 פוטונים μmol מ -2 s -1 עם photoperiod של אור 8 שעות ב 22 ° C ו 16 שעות חושך על 20 מעלות צלזיוס במשך שבוע 1. יחסית לחות נקבע ל 70%. שתילים היו להשקות במי ברז לפי הצורך כדי לשמור על האדמה מלהפוך יבש. שני שתילים של גודל דומה מושתלים אז 4 "סירים בקוטר המכילים אדמה MetroMix 500 וגדלה למשך 3 שבועות נוספים באותם תנאים כמו 1.1. Pseudomonas syringae (PST) הוא בתחילה T מפוספס על מלכים ב 'בינוני (חישוב העומק מתבצע ביחס) צלחות (לליטר: 20 גרם Proteose Peptone, 0.1975 גרם MgSO 4, גליצרול 1%, 1.5 גרם K 2 HPO 4, 18 אגר ז) גדל ל יומיים ב 28 מעלות ג מושבה אחת נאספים, מעורבבים לתוך נוזל 300μl מלכים ב 'בינונית (20 גרם Proteose peptone, 0.1975 גרם MgSO 4 </sub>, 10 גליצרול מ"ל, 10 מ"ל של 100x המניות K 2 HPO 4 (1.5 גרם של K 2 HPO 4 ב 10 מ"ל של H 2 O), ומפזרים על מלכים ב 'צלחת בינונית. זה תרבותי על הלילה ב 28 ° C. הבידוד חיידקים מוכן ידי מגרדים את החיידק בתרבית מהצלחת חישוב העומק מתבצע ביחס ל -20 מ"ל H 2 O. OD 600 של 0.03 (~ 10 6 CFU / ml) מוכן ב L 1 מתוך המאגר חיסון (10 mM MgCl 2 + 400 μL Silwett-70). מאגר חיסון מינוס חיידקים הוכן פתרון שליטה. 2. חיסון של עגבניות עם pst ו-H 2 O 2 Histochemical הכתם ארבעה מפעלים בשבוע ישנים מחוסן ושלח יד אל הפתרון חיסון מעל 30 שניות. שקיות פלסטיק שקוף הועלו על הצמחים מיד לאחר חיסון. Diaminobenzidine 3'-3 "(DAB) כתם 11 הוכן (1 מ"ג / מ"ל DAB ב H 2 O, pH 3.8 (HCL)) 3 דays לפני השימוש כדי להשיג solubilization מלאה. הפתרון הוא התנדנד לערבב בטמפרטורת החדר. עשרים וארבע שעות לאחר הטיפול, עלה הרחיב באופן מלא הוסר, להציב DAB כתם בצד אפידרמיס מעלה, אבק שחדר במשך 15 דקות. העלים הונחו לאחר מכן בטמפרטורת החדר בחושך במשך הלילה על מכתים. העלים היו מבושלים באתנול 95% עבור 10 דקות, ולאחר מכן שמר על אתנול 75%. 3. הפקת החלבון לאחר הקציר, עלי עגבניות נטחנו לאבק דק עם חנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי. עבור 0.5 גרם של רקמה, להוסיף 1.25 מ"ל טריס pH 8.8 שנאגרו פנול 1.25 מ"ל / 0.5 גרם של מיצוי המאגר (0.1 מ 'טריס-HCl pH 8.8, 10 mM EDTA, סוכרוז 0.9 M) ולאחר מכן המשך שחיקה דקות עוד כמה ב עשן מכסה המנוע. להעביר את תמצית לצינור צנטריפוגות Oakridge (תרמו פישר סיינטיפיק החברה Nalgene) ו להתסיס במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר. סרכזת XG ב 5000ו 15 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. להעביר את השלב פנול מלמעלה צינור נקי חדש. גב לחלץ את השלב מימית עם נפח שווה חילוץ חיץ פנול, להתסיס על שייקר למשך 30 דקות. סרכזת ולהעביר את תמצית לצינור פלקון חדש. חזור על השלב הנ"ל פעם נוספת ולהעביר את תמצית לצינור Oakridge חדש. להאיץ חלבונים המופקים על ידי הוספת פנול 5 כרכים של אמוניום אצטט מ 0.1 ב 100% מתנול (מאוחסן ב -20 ° C). מערבולת ו דגירה ב -20 מעלות צלזיוס למשך לילה. לאסוף את החלבון גלולה ידי צנטריפוגה ב 20,000 XG, 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לשטוף את פי 2 גלולה עם אצטט 0.1M קר אמוניום ב מתנול 2 פעמים עם אצטון קר 80%. הוסף 1.5 מ"ל אתנול 70% קר גלולה ו להשעות. להעביר צינור microcentrifuge 2 מ"ל (ארה"ב מדעי) ו צנטריפוגות ב 14000 סל"ד, 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסר אתנול. לייבש בקצרה גלולה ב concentrator SpeedVac ו להתמוסס extr חלבוןמאגר פעולה, כגון הפקת חלבון ReadyPrep ערכת מגיב 3 (8 דשן M, בחורים 4%, 40 מ"מ טריס בסיס, 2 מ 'Thiourea) (Bio-RAD). סרכזת ב 14,000 סל"ד ו – 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי ליצור גלולה. איסוף supernatant. למדוד את ריכוז החלבון באמצעות assay CB-X חלבון על פי הוראות היצרן (Geno טכנולוגיה). 4. לדוגמא הכנה וסימון פפטיד עם cysTMTs הכן מדגם חלבון בריכוז של 2-5 מיקרוגרם / μL. כאן אנו משתמשים 100 מיקרוגרם של חלבון על כל תג המונית, 20 μl-50 דגימות μL. לצורך ניסוי זה 6 כל התגים היו בשימוש. הוסף נפח שווה של חיץ אלקילציה (100 מ"מ טריס-HCl pH7.5, 200 מ"מ iodoacetamide) מדגם חלבון לחסום את הקבוצה תיאול חינם. למאגר יש להכין טרי. אלקילציה מתבצעת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. להאיץ את החלבון על ידי הוספת 1 מ"ל של אצטון 80% קר -20 מעלות צלזיוס למשך לילה. גלולה את החלבון על ידי צנטריפוגה ב 14000סל"ד, 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לשטוף 3 פעמים גלולה עם אצטון 80% vortexing בכל פעם. הסר את supernatant ולאפשר לאוורר בזמן יבש על הקרח. Resuspend גלולה במאגר תמוגה μL 50 (6 מ דשן, 50 מ"מ טריס הבסיס, 1 mM EDTA). 0.5 μL של 100 מ"מ טריס (2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) נוסף ואז לצמצם את הקשרים דיסולפיד ידי דוגרים למשך שעה בטמפרטורת החדר. הכן התגים על ידי הוספת 20 μL של אצטוניטריל את צינורות מגיב כדי solubilize את התגים. מערבולת ומסובב עד לתחתית. לשטוף את TCEP נוספת באמצעות מכשיר Microcon 3KD מסנן צנטריפוגלי (Millipore). הוסף 50 מדגם μL לעמודה 3KD Microcon, ו 50 חיץ תמוגה μL לעמודה. סרכזת במשך 15 דקות ב XG 10000 ו – 4 ° C. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של שלוש פעמים. הסרה של עמודה להפוך לתוך צינור נקי. סרכזת במשך 5 דקות על XG 1000 ו – 4 ° C. בדוק את ה-pH. במידת הצורך, להתאים את ה-pH ל 7.0-8.0 עם 1 M HCl. הוסף 5 μL של cysTMמגיב T למדגם אחד (ערכת מגיב cysTMT מספק 20 תגי μL עד 500 מיקרוגרם חלבון. שיטה זו משתמשת 100 מיקרוגרם חלבון, ולכן אנו משתמשים חמישית התג.). אפשר להמשיך את התגובה של 2 שעות בטמפרטורת החדר. דוגמאות שולבו עם מאגר לדוגמה Laemmli (BIO-RAD) ביחס של 1:1. 5. הסרת הפירוק ללא הגיב לדוגמא תג דוגמאות היו מבושלים 5 דקות ומופרד על הג'ל יצוקה polyacrylamide 12% (BIO-RAD). ג'ל היה שטף שלוש פעמים בתוך 5 דקות intervals עם סינון H 2 O ו מוכתם Coomassie כחול (Bio-RAD) במשך שעה 1. ג 'דה היה מוכתם לילה עם H 2 O. שנים עשר שברים נאספו מנתיב כל ג'ל. שברים נקבעו על ידי ריכוזים הלהקה חלבון. שברים היו קצוץ לחתיכות 1 מ"מ ואסף לתוך צינור 1.5 מ"ל. חתיכות ג'ל היו דה מוכתם באמצעות אצטוניטריל 50% ו 0.1 M אמוניום ביקרבונט ב H 2 </תת> א ' שלב זה יש לחזור עד בצבע כחול יוסר חתיכות ג'ל (~~~HEAD=NNS 3-4 פעמים, 15 דקות בכל פעם). דה המוכתמים חתיכות ג'ל יובשו באמצעות אצטוניטריל 100% (לכיסוי חלקי ג'ל) במשך 15 דקות, supernatant מוסר, ואת חתיכות מיובשים באמצעות SpeedVac. ממיסים טריפסין (Promega) בשעה 01:10 (טריפסין: חלבון) יחס בנפח זהה (לדוגמה שכותרתו נקווה כמו) של סודה 25 אמוניום מ"מ. לדוגמה, 600 מיקרוגרם חלבון מדגם בהיקף של 500 μL צריך טריפסין 60 מיקרוגרם מומס μL 500 של אמוניום ביקרבונט 25 מ"מ. מוסיפים את הפתרון טריפסין על חתיכות ג'ל ולהגדיר על הקרח כדי rehydrate. אם חלקים לא מכוסים להוסיף 50 mM אמוניום ביקרבונט המאגר. לאחר להחזרת נוזלים, דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות. הסר את תמצית חלבון נוזלי מן דגימות מודגרות. לעצור את התגובה להסיר כל לעכל חלבון הנותרים על ידי כיסוי חלקי ג'ל עם חומצה פורמית 5%, 50% אצטוניטריל .. ללחוץ את חתיכות ג'ל 20 דקות בחדר temperature. העברת supernatant על דוגמיות שחולצו חלבון מן 5.7. חזור על פעולות החילוץ פעמיים. לייבש את הפפטידים ולחלצם באמצעות SpeedVac. 6. לדוגמא העשרה של cysTMT שכותרתו למוצרי פפטידים הוספת שיפוע של שרף נגד TMT ל 0.5 מ"ל צינורות עבור slurry 50%. (צבע נקבע מריכוז הלהקה ג'ל חלוקה. אם אוסף חלק מורכב הלהקה כהה, שרף יותר יש צורך. שברים עם להקות חלשות דורשים שרף פחות יש פחות חלבון.) שרף הוא שטף מכן שלוש פעמים עם נפח עמודה אחת של 1x-טריס בופר סליין (TBS) (25 מ"מ טריס, 0.15 מ 'NaCl, pH 7.2) (Thermo Scientific מחקר פירס אבקות חלבון). הוספת 200 1xTBS μL מדגם זה. דוגמאות נוספות לאחר מכן שרף נגד TMT (Thermo Scientific מחקר פירס אבקות חלבון) ו נסער בטמפרטורת החדר למשך שעה 2 ואחריו מתנדנד בין לילה ב 4 ° C. הוסף מדגם לעמודה (rmo המחקר המדעי פירס אבקות חלבון). לשטוף כל עמודה שלוש פעמים עם 1x 200 כפות μL. זה בעקבות כך עם הכביסה שלוש פעמים עם בחורים 0.05% (מומס 1x כפות). הטור הוא שטף מכן שלוש פעמים עם אוריאה M 4 ב 1x TBS. שני 100 מיקרוליטר של H 2 O לאחר מכן נעשה שימוש כדי לשטוף את העמודה שלוש פעמים. מדגם זה הוא eluted שלוש פעמים עם חיץ elution μL 200 50% (50% אצטוניטריל, TFA 0.4%). דוגמאות מיובש אז concentrator ואקום. 7. המוני ניתוח ספקטרומטריית Resuspend את דגימות μL 12 אצטוניטריל של 3% עם חומצה פורמית 0.1% ו להזריק 5 μL ישירות על Eksigent NanoLC-1D נוזל גבוהה כרומטוגרפיה בעמודה הלחץ (AB SCIEX, ארה"ב). פפטידים יופרדו על השנייה Proteopep C18 מזהה בעמודה 75 מיקרומטר x 20 ס"מ מטרה חדשה, ארה"ב) באמצעות שיפוע 4-60% (: אצטוניטריל 3%, חומצה פורמית 0.1%, B: אצטוניטריל 97%, פורמית 0.1% חומצה)ב 3 μL / דקה מעל 60 דקות. מדעי Thermo LTQ Orbitrap XL ספקטרומטר מסה שימש לזיהוי פפטידים באמצעות 2 x 3 העליון הניסוי המורכב בשלב MS אחת ואחריה רכישת 3 MS / MS ספקטרום עם פיצול גבוהה יותר אנרגיה C-מלכודת (HCD) ניתוק ואחריו 3 MS / MS עם התנגשות המושרה דיסוציאציה (CID) לזיהוי חלבונים. פרמטרים במצב זה היו: בידוד רוחב: 3.0 מ '/ z: התנגשות אנרגיה: 50% (10% עם שני צעדים). פפטידים רק כפליים, פי שלוש ו-טעונים נבחרו הפיצול. פרמטרים דינמיים הוצאת נקבעו ל: חזור לספור = 1; משך חזור = 60; רשימת הרחקת size = 500; הרחקת משך = 28. ערכי היעד הם: MS = 5 ה 5: MS / MS (HCD) = 1 ה 5. פעמים יון ההעברה נקבעו ל 500 עבור FTMS ו -300 עבור MS / MS (HCD). שני microscans נדרשו ספקטרום HCD. 8. מסד הנתונים חיפוש quantitation נתוני הבולשת ו HCD שנרכשו היוnalyzed באמצעות Thermo Scientific תוכנה Proteome Discoverer 1.2 (Thermo Scientific מחקר פירס אבקות חלבון) דרך עבודה מסועפת אשר מיושם כתב הקוונטים של יון (20 עמודים לדקה המונית הסובלנות של יונים שבר) לכמת את היחס. קטע נפרד מעובד ספקטרה 2 MS לאורך הספקטרום בורר, מנרמל ספקטרום, ואת מקבץ צמתים ספקטרום. הנתונים נערכו חיפושים אחר כך נגד מנוע החיפוש SEQUEST. 20 עמודים לדקה סובלנות המונית היה בשימוש. שינויים סטטיים הוגדרו מגיב cysTMT (304.18 דה) ושינויים דינמיים כולל זרחון וחמצון מתיונין (15.99 דא). נתונים מותאם אישית עבור Solanum lycopersicum היה מורכב באמצעות RNA נתונים (עם כ 350,000 כניסות מאוניברסיטת הארוורד) 13 שימש בשני המקרים. 9. נציג תוצאות תמונה מייצגת של עגבניות עלה צמח מלאה עלה Pseudomonas הוא מחוסןשמוצג באיור 1. ההבדל בין שליטה מטופלים שטופלו Pseudomonas עלים הוא ציין. לאחר העלים מוסרים ומוכתם באמצעות DAB, תהליך דה מכתים מאפשר כתם histochemical להראות סימנים של ROS ברקמה עלה (איור 2). איור 2 א הוא נציג של עלה שליטה עם כתמים לא. 2B איור מייצג עלה שטופלו מכתים Pseudomonas וחיובי לייצור H 2 O 2. דוגמה של פלט נתונים Proteome Discover של חלבון מווסת חמזור דיפרנציאלי מוצגת באיור 3. חלבון זה הוא ferredoxin-1 ידוע חמזור חלבון מוסדר 14 ו הוכח למלא תפקיד בהגנה על עגבניות Pseudomonas PV syringae 15. עוצמת שיא מלאה בין דגימות מחוסן משמש להשיג כימות יחסי, אשר הראו שינויים משמעותיים ferredoxin-1 תקנה חיזור (p <0.05). פסגות בעוצמה גבוהה עולה כי חלבון זה הוא מתחמצן בתגובה לטיפול הפתוגן. איור 4 הוא דוגמה של פלט נתונים Proteome Discover של חלבון שיש לו תקנה חיזור דומה של חלבון בין שליטה לבין מדגם מחוסן. פסגות בעוצמה דומה מציע את נוכחותו של אג"ח דיסולפיד לא מוסדר על ידי שינוי בטיפול. השיטה תהיה מהפכה כמה מדענים לזהות cysteines תגובה חמזור ו disulfides 10. באיור 1. תמונה מייצגת של עגבניות מחוסן עוזב עם פתרון שליטה (א) ו Pseudomonas (ב '). <בכיתה תוחלת = "pdflinebreak"> איור 2. התמונה נציג מכתים DAB של עגבניות מחוסן עוזב עם פתרון שליטה (א) ו Pseudomonas (ב '). העלים היו מוכתמים באמצעות diaminobenzidine '3'-3. כלורופיל הוסר מעלי ידי הרתחת באתנול 95%. צביעה כהה מעיד על קיומו של H 2 O 2. רק עלים מחוסן עם התרבות חיידקים הראו כתמים כהים. איור 3. דוגמה של פלט Proteome נתונים של Discover ferredoxin-1, חלבון מווסת חמזור דיפרנציאלי 14. עוצמת שיא מעל השיא זה משמש כימות מוחלטת. עוצמת שיא מלאה בין דגימות מחוסן משמשלבצע כימות יחסי. איור 4. דוגמה של פלט נתונים Proteome Discover של חלבון שיש לו עוצמת שיא דומה בין שליטה לבין מדגם מחוסן. פסגות בעוצמה דומה מציע את נוכחותו של אג"ח דיסולפיד לא מוסדר על ידי שינוי בטיפול.