Создание Переходные поры клеточной мембраны с помощью стандартных струйных принтеров
Summary
Описание методов, используемых для преобразования HP DeskJet 500 принтеров в bioprinter. Принтер способен обрабатывать живые клетки, что приводит к переходной поры в мембране. Эти поры могут быть использованы включить малые молекулы, в том числе люминесцентные G-актин, в печатных клеток.
Abstract
Bioprinting имеет широкий спектр применения и значение, в том числе тканевой инженерии, прямое применение терапии клетки, и биосенсоров микротехнологий. 1-10 Недавно тепловой струйной печати также используется для генной трансфекции. 8,9 теплового процесса струйной печати было показано, что временно нарушить клеточные мембраны без ущерба для жизнеспособности клеток. Переходные поры в мембране может быть использован для внедрения молекул, которые иначе были бы слишком велики, чтобы пройти через мембрану, в цитоплазме клеток. 8,9,11
Применение демонстрируется здесь является использование тепловой струйной печати для включения флуоресцентно меченных г-актина в клетках мономеров. Преимущество использования тепловой струйной печати для введения в клетки молекул является то, что метод является относительно доброкачественный к клеткам. 8, 12 Жизнеспособность клеток после печати было показано, что похожа на стандартную ячейку плаTing методов 1,8. Кроме того, струйная печать может обрабатывать тысячи клеток в течение нескольких минут, что значительно быстрее, чем ручной микроинъекции. Поры созданы печати были показаны, чтобы закрыть в течение примерно двух часов. Однако, есть ограничение на размер пор создал (~ 10 нм) с этой техникой печати, которая ограничивает прием инъекционных клетки маленькие белки и / или частиц. 8,9,11
Стандартный HP DeskJet 500 принтеров был изменен, чтобы обеспечить клетки печати. 3, 5, 8 крышку принтера была удалена и механизм подачи бумаги была обойдена с помощью механического рычага. Этапе был создан, чтобы обеспечить размещение микроскоп слайды и покровные непосредственно под печатающей головкой. Струйные картриджи были открыты, чернила был удален, и они были очищены до использования с ячейками. Печать шаблон был создан с помощью стандартного программного обеспечения рисунок, который затем управлять принтером с помощью простой команды печати. 3T3 фиброзновзрывы были выращены в слиянии, трипсином, а затем ресуспендировали в фосфатный буферный солевой раствор с растворимым флуоресцентно меченных г-актин мономеров. Клеточной суспензии пипеткой в картридже и линии клеток были напечатаны на стекле микроскопа скользит крышкой. Живые клетки были обследованы с помощью флуоресцентной микроскопии и актин было найдено по всей цитоплазме. Включение флуоресцентных актина в клетке обеспечивает съемку короткого времени цитоскелета динамики и полезной для широкого круга применений. 13-15
Protocol
Discussion
Процесс преобразования стандартного настольного принтера для струйной bioprinting не особенно сложно. Самым сложным шагом является определение, как обойти механизм подачи бумаги, который зависит от марки и модели используемого принтера. Тем не менее, это относительно просто, когда датчик подачи бумаги является механическим, как описано здесь. Для моделей с оптическими датчиками корма, другие методы, возможно, должны быть использованы, чтобы обмануть принтер, думая, что используется бумага, например, можно провести небольшой кусочек бумаги через принтер, пока он печатает на предметное стекло микроскопа. Обход механизма подачи бумаги, вероятно, будет самым сложным шагом в применении этих процедур для различных моделей принтеров.
При построении этапе провести покровные для печати, важно обеспечить правильное положение и высоту. Этап должен предусматривать покровное быть помещены в середине области печати. Кроме того, он должен плТуз покровное на должном высоте, чтобы зазор для картриджей перейти слайд, не нарушая его. Точная высота этапе будет зависеть от модели принтера.
Для того, чтобы печатные клетки не переплетаются, слайды были помещены в инкубатор сразу после печати примерно на 30 минут, чтобы для сотовых вложения дополнительных средств массовой информации, прежде чем рост клеток был добавлен. Поскольку клетки были напечатаны в решение, которое включает в себя большое количество PBS клетки не высыхают и остаются жизнеспособными. Клетки были обследованы с помощью флуоресцентной микроскопии для визуализации распределения помеченных г-актин мономеров внутри клетки (рис. 1, 5-7). При печати с 3T3 фибробласты, 5 показан репрезентативный результат, с актином вызывает большую часть клетки светятся, но демонстрации линий повышенной яркости. Включение флуоресцентно отмеченных г-актина в цитоскелета являетсяполезны для изучения динамики цитоскелета и клеточных механике. 12-15 ограничением этого метода является то, что она применима только для молекул и белков, которые имеют диаметр меньше, чем примерно 10 нм.
Для того, чтобы клетки были фактически обрабатывается преобразованы принтер, DAPI (1:5000 в PBS) был добавлен в bioink вместо половины объема чистого PBS. Флуоресцентные пятна DAPI связывается с аминокислотой богаты часть ДНК находится в ядре. Поэтому DAPI является полезным пятно в флуоресцентной визуализации ядер печатных элементов. На рисунке 6 показан представитель образ ячейки отображается как Alexa Fluor 488 (актин) и DAPI (ядро) флуоресценции с наложением изображения и другое. На рисунке 7 также показывает, как клетки высветится раз г-актин мономеров были включены в то время как не-биологический материал, который был сдан на хранение в пример не будет светиться из-за absencе г-актин мономеров.
Одним из важных моментов для bioprinting является водных сред, используемых для bioink. Было установлено, что с использованием стандартных средств массовой информации рост клеток с сывороткой дали противоречивые результаты. Это, скорее всего из-за засорения печатающей головки на сывороточных белков. Использование ФСБ увеличили последовательность печатных шаблонов, а число клеток на хранение. Одним из недостатков использования PBS том, что клетки не должны оставаться в суспензии в течение длительных периодов времени. Тем не менее, фибробласты, в этих примерах были в состоянии терпеть bioink условиях, по крайней мере час без изменения жизнеспособности клеток. Это согласуется с нескольких до выводов, которые сообщают, что клетки с помощью печатного механизма тепловой струйной было показано, что высокий уровень жизнеспособности. 2-8
Это изменение настройки принтера можно использовать для приложений, отличных от клетки печати. 16-22 Матрица белков, таких как коллаген или fibroneХТИН, могут быть легко распечатаны на подложки с этой техникой, которая может быть полезна для сотовых кучность стрельбы. Так, например, коллагена типа я напечатал в соответствие модели приведет соответствие коллагена субстраты, которые можно использовать для экстракорпорального исследования клеточных культур. 17 В дополнение к матрице белков, другие молекулы, в том числе факторов роста, могут быть надежно локализованы на подложки для клеточных исследований и потенциального терапевтического применения 18.
Основным недостатком дизайна описанных выше шагов, что этот принтер не способен печатать на более чем одном измерении. Это ограничивает потенциал для использования в узорной приложений, таких как печать эшафот. Для обеспечения 3D печать, специализированные этапе необходимо использовать. Этап должен иметь дополнительные корректировки высоты слой за слоем отложение bioink.
Bioprinting показала свою перспективность в качестве эффективного и экономически эффективным методом тканевой инженерии, Генной трансфекции micropatterning и изготовление микрочипов 1-12, 16-22 будущих приложений этого типа устройств являются многочисленными, в том числе:. Создание под контролем и узорные сотовой микросреды, включение макромолекул в цитоплазме клетки, а также осаждение клеток на строительные леса и структур, которые не встречаются в природе и эффективно.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Томас Боланд за идею использования принтеров HP DeskJet для сотовых печати. Финансирование этого проекта из NSF RII-EPS 0903795 и NIH K25 HL0922280.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| HP DeskJet 500 | Hewlett-Packard | C2106A | Discontinued from manufacturer. Purchased refurbished DEC Trader. |
| HP 26 Black Ink Cartridge | Hewlett-Packard | 51626A | |
| Actin from rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate, 200 μg | Invitrogen | A12373 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | ICN1860454 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3002201 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco | VLF 797 | Optional housing for keeping printer aseptic |
References
- Calvert, P. Materials science. Printing cells. Science. 318, 208-209 (2007).
- Mironov, V., Reis, ., Derby, B. Review: Bioprinting: A beginning. Tissue Eng. 12, 631-634 (2006).
- Pepper, M. E., Parzel, C. A., Burg, T., Boland, T., Burg, K. J. L., Groff, R. E. Design and Implementation of a two-dimensional inkjet bioprinter. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 3-6, 6001-6005 (2009).
- Campbell, P., Weiss, L. Tissue engineering with the aid of inkjet printers. Expert Opin. Biol. Th. 7, 1123-1127 (2007).
- Boland, T., Xu, T., Damon, B., Cui, X. Application of inkjet printing to tissue engineering. Biotechnol. J. 1, 910-917 (2006).
- Mironov, V., Prestwich, G., Forgacs, G. Bioprinting Living Structures. J. Mater. Chem. 17, 2054-2060 (2007).
- Xu, T., Rohozinski, J., Zhao, W., Moorefield, E. C., Atala, A., Yoo, J. J. Inkjet-mediated gene transfection into living cells combined with targeted delivery. Tissue Eng. Part A. 15, 95-101 (2009).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z., Boland, T. Cell Damage Evaluation of Thermal Inkjet Printed Chinese Hamster Ovary Cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Saunders, R., Derby, B. B. i. o. p. r. i. n. t. i. n. g. Inkjet Deposition. Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology. 15, (2010).
- Prabha, S., Zhou, W., Panyam, J., Labhasetwar, V. Size-dependency of nanoparticle mediated gene transfection: studies with fractioned nanoparticles. Int. J. Pharm. 244, 105-115 (2002).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Apodaca, G. Endocytic Traffic in Polarized Epithelial Cells: Role of Actin and microtubule Cytoskeleton. Traffic. 2, 149-159 (2001).
- Hotulainen, P., Llano, O., Smirnov, S., Tanhuanpää, K., Faix, G., Rivera, C., Lappalainen, P. Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis. J. Cell Biol. 185, 323-339 (2009).
- Allen, P. G. Actin filament uncapping localizes to ruffling lamellaw and rocketing vesicles. Nat Cell Biol. 5, 972-979 (2003).
- Cooper, G. M., Miller, E. D., Desesare, G. E., Usas, A., Lensie, E. L., Bykowski, M. R., Huard, J., Weiss, L. E., Losee, J. E., Campbell, P. G. Inkjet-based biopatterning of bone morphogenetic protein-2 to spatially control calvarial bone formation. Tissue Eng. Part A. 16, 1749-1759 (2010).
- Deitch, S., Kunkle, C., Cui, X., Boland, T., Dean, D. Collagen matrix alignment using inkjet printer technology. Proc. 1094 (DD. , 7-16 (2008).
- Ilkhanizadeh, S., Teixeira, A., Hermanson, O. Inkjet printing of macromolecules on hydrogels to steer neural stem cell differentiation. Biomaterials. 28, 3936-3943 (2007).
- Ringeisen, B. R., Orthon, C. M., Barron, J. A., Young, D., Sparago, B. J. Jet-based methods to print living cells. Biotechnol. J. 1, 930-948 (2006).
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260, 920-926 (1993).
- Okamoto, T., Suzuki, T., Yamamoto, N. Microarray fabrication with covalent attatchment of DNA using Bubble Jet technology. Nature Biotechnol. 18, 438-441 (2000).
