Het creëren van voorbijgaande celmembraan poriën met een standaard inkjetprinter
Summary
Een beschrijving van de methoden die worden gebruikt om een HP DeskJet 500-printer te zetten in een bioprinter. De printer kan verwerken levende cellen die transient poriën veroorzaakt in het membraan. Deze poriën kan worden gebruikt om kleine moleculen zoals fluorescerende G-actine nemen in de gedrukte cellen.
Abstract
Bioprinting heeft een breed scala van toepassingen en het belang, met inbegrip van tissue engineering, directe cel applicatie therapieën, en biosensor microfabricage. 1-10 Onlangs heeft thermische inkjettechnologie ook gebruikt voor gen transfectie. 8,9 De thermische inkjet printing proces werd aangetoond dat tijdelijk verstoren de celmembranen zonder dat dit invloed levensvatbaarheid van de cellen. De tijdelijke poriën in het membraan kunnen worden gebruikt om moleculen die anders te groot zijn om door het membraan in de cytoplasma. 8,9,11 voeren
De toepassing wordt hier gedemonstreerd is het gebruik van thermische inkjettechnologie voor de integratie van fluorescent gelabelde g-actine-monomeren in de cellen. Het voordeel van thermische inktstraaldrukkers om moleculen injecteren in cellen is dat de techniek relatief goedaardige aan cellen. 8, 12 levensvatbaarheid van de cellen na afdruk is gebleken dat vergelijkbaar met standaard cel plaTing methoden 1,8. Daarnaast kunnen inkjet printen verwerken duizenden cellen in een paar minuten, dat is veel sneller dan handmatige micro-injectie. De poriën die door drukken is gebleken sluiten binnen ongeveer twee uur. Er is echter een grens aan de grootte van de poriën gemaakt (~ 10 nm) met deze druktechniek, waarbij de techniek beperkt tot injecteren cellen met kleine proteïnen en / of deeltjes. 8,9,11
Een standaard HP DeskJet 500-printer is gewijzigd, zodat voor cel af te drukken. 3, 5, 8 De deksel van de printer werd verwijderd en het papierinvoermechanisme was gepasseerd behulp van een mechanische hefboom. Een podium is gemaakt om voor de plaatsing van objectglaasjes en dekglaasjes kan direct onder de printkop. Inktpatronen werden geopend, de inkt werd verwijderd en ze werden gereinigd voor gebruik met cellen. De drukkerij patroon is gemaakt met behulp van standaard tekensoftware, die vervolgens de printer gecontroleerd door middel van een eenvoudige printopdracht. 3T3 fibroontploffing werden gekweekt tot confluentie, getrypsiniseerd, en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in fosfaat gebufferde zoutoplossing met oplosbare fluorescent gelabelde g-actine-monomeren. De celsuspensie werd gepipetteerd in de inktpatroon en lijnen cellen werden gedrukt op microscoopglasplaatjes dekglaasjes. De levende cellen werden afgebeeld met behulp van fluorescentie microscopie en actine werd gevonden in het cytoplasma. Integratie van TL-actine in de cel zorgt voor beeldvorming van de korte tijd cytoskelet dynamiek en is nuttig voor een breed scala aan toepassingen. 13-15
Protocol
Discussion
Het proces om een standaard inkjet desktop printer voor bioprinting is niet bijzonder moeilijk. De meest uitdagende stap is het bepalen van hoe het papierinvoermechanisme, die afhankelijk is van het merk en model van de printer gebruikt te omzeilen. Dit is echter relatief eenvoudig de papierinvoer sensor mechanische zoals hier beschreven. Voor modellen met optische-feed sensoren, kunnen andere technieken moeten worden ingezet om de printer te laten denken is het papier met behulp van, bijvoorbeeld, kan men een klein stukje papier door de printer tijdens het afdrukken op de microscoop dia. Het omzeilen van de papierinvoermechanisme is waarschijnlijk de moeilijkste stap in de toepassing van deze procedures om andere printer modellen.
Bij de bouw van een fase van de dekglaasjes vasthouden voor het drukken is het belangrijk om een goede uitlijning en hoogte. Het podium moet het mogelijk maken voor het dekglaasje te worden geplaatst in het midden van het afdrukgebied. Bovendien, het zou moeten place het dekglaasje op een voldoende hoogte om goedkeuring voor de inktpatroon door te geven over de dia zonder verstoring van het. De exacte hoogte van de fase zal afhangen van de printer model.
Om ervoor te zorgen dat de afgedrukte cellen niet weg te krijgen gewassen, werden de dia's in een incubator geplaatst direct na het afdrukken van ongeveer 30 minuten om voor celhechting voordat aanvullende celgroei media werd toegevoegd. Omdat de cellen werden gedrukt in een oplossing die veel PBS de cellen niet uitdroogt en bleef levensvatbare omvat. Cellen werden belicht met fluorescentiemicroscopie de verdeling van het gelabelde g-actine monomeren in de cel (figuren 1, 5-7) visualiseren. Bij het afdrukken van 3T3 fibroblasten, Figuur 5 toont een representatief resultaat met actine waardoor veel van de cel te fluoresceren maar presentatie lijnen van verhoogde helderheid. De integratie van fluorescent gelabeld g-actine in het cytoskelet isnuttig voor de studie van cytoskelet dynamiek en cellulaire mechanica. 12-15 Een beperking van deze techniek is dat alleen voor moleculen en eiwitten die diameters kleiner dan ongeveer 10 nm.
Om cellen daadwerkelijk worden verwerkt door de printer omgezet, werd DAPI (1:5000 in PBS) aan het bioink in plaats van de helft van het volume zuivere PBS. De fluorescerende vlek DAPI bindt aminozuur rijke porties DNA in de kern. Daarom DAPI is nuttig vlek in fluorescent beeldvorming kernen van de gedrukte cellen. Figuur 6 toont een representatief beeld van een cel getoond zowel Alexa Fluor 488 (actine) en DAPI (kern) fluorescentie met een overlaybeeld van beide. Figuur 7 illustreert hoe de cellen eenmaal lichten de g-actine monomeren zijn opgenomen, terwijl niet-biologisch materiaal dat is afgezet in het monster niet fluoresceren door de absence van g-actine monomeren.
Een belangrijke overweging voor bioprinting is de waterige media wordt gebruikt voor de bioink. Het bleek dat met behulp van standaard celgroei media met serum inconsistente resultaten opgeleverd. Dit is waarschijnlijk te wijten aan verstopping van de print-spuitkanaaltjes door serum eiwitten. Het gebruik van PBS om de consistentie van gedrukte patronen en het aantal cellen, werd gedeponeerd. Een nadeel van PBS dat cellen niet worden gelaten in de suspensie gedurende langere tijd. Echter, fibroblasten in deze voorbeelden waren in staat om de bioink voorwaarden voor minstens een uur tolereren, zonder verandering in de levensvatbaarheid van de cellen. Dit is consistent met diverse eerdere bevindingen, die melden dat cellen afgedrukt via thermische inkjet mechanismen is aangetoond dat een hoge levensvatbaarheid tarieven. 2-8
Deze aangepaste installatie van de printer kan worden gebruikt voor andere toepassingen dan de cel af te drukken. 16-22 Matrix eiwitten, zoals collageen of fibronectin, gemakkelijk kunnen worden afgedrukt op substraten met deze techniek, die nuttig zijn voor cellen patronen. Bijvoorbeeld collageen type I gedrukt in lijn zal resulteren in lijn collageen substraten die kunnen worden gebruikt voor in vitro celkweek studies. 17 Naast matrixeiwitten andere moleculen, zoals groeifactoren, betrouwbaar kan worden gelokaliseerd op substraten voor celstudies en potentiële therapeutische toepassingen. 18
Een belangrijke beperking van het ontwerp zoals hierboven beschreven stappen is dat deze printer niet kan afdrukken in meer dan een dimensie. Dit beperkt de mogelijkheden voor gebruik in patroon toepassingen zoals steiger afdrukken. Om voor 3D-printing, een gespecialiseerde stadium moet worden gebruikt. Het podium dient te beschikken over incrementele hoogte verstelbaar voor laag-voor-laag afzetting van bioink.
Bioprinting heeft aangetoond belofte als een efficiënte en kosten-effectieve methode voor tissue engineering, Gen transfectie micropatterning en microarray fabricage 1-12, 16-22 De toekomstige toepassingen van dergelijke inrichting zijn vele, waaronder:. Creëren van gecontroleerd en patronen cellulaire micromilieus, opname van macromoleculen in cytoplasma en afzetting van cellen op steigers en structuren die niet de natuur voorkomen of efficiënt.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dr Thomas Boland erkennen voor het idee van het gebruik van de HP DeskJet printers voor cel af te drukken. De financiering voor dit project uit NSF RII-EPS 0903795 en NIH K25 HL0922280.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| HP DeskJet 500 | Hewlett-Packard | C2106A | Discontinued from manufacturer. Purchased refurbished DEC Trader. |
| HP 26 Black Ink Cartridge | Hewlett-Packard | 51626A | |
| Actin from rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate, 200 μg | Invitrogen | A12373 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | ICN1860454 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3002201 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco | VLF 797 | Optional housing for keeping printer aseptic |
References
- Calvert, P. Materials science. Printing cells. Science. 318, 208-209 (2007).
- Mironov, V., Reis, ., Derby, B. Review: Bioprinting: A beginning. Tissue Eng. 12, 631-634 (2006).
- Pepper, M. E., Parzel, C. A., Burg, T., Boland, T., Burg, K. J. L., Groff, R. E. Design and Implementation of a two-dimensional inkjet bioprinter. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 3-6, 6001-6005 (2009).
- Campbell, P., Weiss, L. Tissue engineering with the aid of inkjet printers. Expert Opin. Biol. Th. 7, 1123-1127 (2007).
- Boland, T., Xu, T., Damon, B., Cui, X. Application of inkjet printing to tissue engineering. Biotechnol. J. 1, 910-917 (2006).
- Mironov, V., Prestwich, G., Forgacs, G. Bioprinting Living Structures. J. Mater. Chem. 17, 2054-2060 (2007).
- Xu, T., Rohozinski, J., Zhao, W., Moorefield, E. C., Atala, A., Yoo, J. J. Inkjet-mediated gene transfection into living cells combined with targeted delivery. Tissue Eng. Part A. 15, 95-101 (2009).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z., Boland, T. Cell Damage Evaluation of Thermal Inkjet Printed Chinese Hamster Ovary Cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Saunders, R., Derby, B. B. i. o. p. r. i. n. t. i. n. g. Inkjet Deposition. Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology. 15, (2010).
- Prabha, S., Zhou, W., Panyam, J., Labhasetwar, V. Size-dependency of nanoparticle mediated gene transfection: studies with fractioned nanoparticles. Int. J. Pharm. 244, 105-115 (2002).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Apodaca, G. Endocytic Traffic in Polarized Epithelial Cells: Role of Actin and microtubule Cytoskeleton. Traffic. 2, 149-159 (2001).
- Hotulainen, P., Llano, O., Smirnov, S., Tanhuanpää, K., Faix, G., Rivera, C., Lappalainen, P. Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis. J. Cell Biol. 185, 323-339 (2009).
- Allen, P. G. Actin filament uncapping localizes to ruffling lamellaw and rocketing vesicles. Nat Cell Biol. 5, 972-979 (2003).
- Cooper, G. M., Miller, E. D., Desesare, G. E., Usas, A., Lensie, E. L., Bykowski, M. R., Huard, J., Weiss, L. E., Losee, J. E., Campbell, P. G. Inkjet-based biopatterning of bone morphogenetic protein-2 to spatially control calvarial bone formation. Tissue Eng. Part A. 16, 1749-1759 (2010).
- Deitch, S., Kunkle, C., Cui, X., Boland, T., Dean, D. Collagen matrix alignment using inkjet printer technology. Proc. 1094 (DD. , 7-16 (2008).
- Ilkhanizadeh, S., Teixeira, A., Hermanson, O. Inkjet printing of macromolecules on hydrogels to steer neural stem cell differentiation. Biomaterials. 28, 3936-3943 (2007).
- Ringeisen, B. R., Orthon, C. M., Barron, J. A., Young, D., Sparago, B. J. Jet-based methods to print living cells. Biotechnol. J. 1, 930-948 (2006).
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260, 920-926 (1993).
- Okamoto, T., Suzuki, T., Yamamoto, N. Microarray fabrication with covalent attatchment of DNA using Bubble Jet technology. Nature Biotechnol. 18, 438-441 (2000).
