Création transitoires pores de la membrane cellulaire à l'aide d'une imprimante jet d'encre standard

1. Conversion de la HP DeskJet 500 Il convient de noter que cette technique devrait travailler avec de nombreux commercialement imprimantes jet d'encre. Toutefois, des imprimantes plus anciennes ont tendance à mieux fonctionner, car ils utilisent des cartouches d'encre avec des buses de diamètre plus grand, qui ne se bouchent pas aussi facilement. En outre, des imprimantes plus anciennes ont tendance à utiliser des capteurs mécaniques d'alimentation papier qui sont plus faciles à contourner. Imprimantes avec des capteurs optiques peut être trompé, mais en utilisant une petite bande de papier sur le bord le plus éloigné de l'imprimante lors de chaque cycle, mais c'est un peu plus difficile que le système mécanique de "truc". Les imprimantes actuellement disponibles dans le commerce qui fonctionnent le mieux sont en basse résolution (DPI). Imprimantes de résolution élevé ont tendance à obstruer plus facilement. La résolution de l'imprimante HP Deskjet 500 est de 300 DPI. Il existe de nombreuses imprimantes disponibles dans le commerce (HP Deskjet série et d'autres) qui ont une résolution de 600 DPI. Ce type d'imprimante peut être utilisé avec seulement une légère augmentation dans la busecolmatage des questions qui peuvent être allégés en utilisant un nettoyage soigneux (section 3). Retirer le boîtier supérieur en plastique de l'imprimante, en libérant plusieurs clips en plastique à partir de la base inférieure de l'imprimante et lentement la levée de l'arrêt en haut. Dévissez la lumière panneau de boutons / affichage du haut de l'imprimante, le laisser branché à la carte mère de l'imprimante. Nettoyer l'intérieur de l'imprimante, en particulier les zones où la cartouche d'encre repose et où se produit l'impression. Repérez les câbles alimentant les mécanismes d'alimentation du papier et de les débrancher de la carte mère. Dans la HP DeskJet 500, ceux-ci se trouvent juste en dessous du bac à papier vers la gauche de l'avant. Localiser mécanisme de détection du papier. Contourner le mécanisme de fixation par une chaîne ou boucle de fil pour servir de poignée de traction manuelle. Dans le HP DeskJet 500, le mécanisme de détection du papier est un levier plastique gris trouve au-dessus et derrière le mécanisme d'alimentation d'impression / papier. Créer une scène devant le mécanisme d'alimentation en papier (où le papier serait alimenté à partir et déposé) afin d'amener les lames d'impression désirées à un niveau juste au-dessous de la tête d'impression de la cartouche. Pour nos expériences, le titulaire expédition en mousse pour tubes de 15 ml à centrifuger a été utilisé avec des lames de microscope plusieurs collées en place dans la zone d'impression pour amener le niveau final des diapositives à la hauteur désirée. Afin de maintenir une technique aseptique, l'imprimante peut être placé dans une armoire standard de biohazard ou hotte à flux laminaire de table. Il est important de noter que la modification d'un commerce à jet d'encre d'imprimante sont généralement annulera la garantie constructeur de l'imprimante. 2. Conversion cartouches d'encre HP (Stock HP 26 cartouche d'encre noire) Retirez la cartouche de son emballage, laissant la bande de protection couvrant les contacts de l'imprimante et tête d'impression pour le moment. Stabiliser le corpsde la cartouche (partie noire), soit avec une pince ou un étau (tout simplement saisir fermement la cartouche à la main habituellement travaillées ainsi), laissant le vert clair dessus de tout obstacle. En utilisant des pinces ou une clé ajustable, saisir le sommet vert de la cartouche et tourner d'avant en arrière plusieurs fois jusqu'à ce qu'elle se libère. Cela ne devrait pas prendre beaucoup de force, mais le haut n'est plus nécessaire, il est donc correct si il se casse lorsque vous le retirez. En utilisant un tournevis, un levier hors de la pièce en plastique transparent maintenant exposée. Encore une fois, cela ne devrait pas prendre beaucoup de force, mais il ne sera pas nécessaire, il est donc correct si il se casse lors de l'enlèvement. Videz tout en restant dans le réservoir. Retirer le ruban protecteur de plastique recouvrant les contacts de l'imprimante et tête d'impression. Rincez soigneusement les réservoirs avec de l'eau. Utilisation d'une pipette ou la seringue pour pousser l'eau à travers les canaux. L'eau sera probablement fuir de la tête d'impression pendantce processus, ce qui est acceptable, et ne causent aucun dommage à la fonctionnalité de la cartouche. Lorsque l'eau soit claire, que la cartouche de sécher. 3. Nettoyage cartouche d'encre Afin de maintenir un environnement d'impression propre, la cartouche d'encre doivent être nettoyés avant et après utilisation. Cela permet aussi d'éviter avec la cristallisation des sels et autre matériel biologique dans la cartouche qui pourrait provoquer des blocages. Entièrement plonger la cartouche dans un bécher rempli d'eau déminéralisée, et sonication pendant 15 minutes avant et après l'impression. Après sonication, retirez la cartouche de l'eau, et secouer l'excédent d'eau. Vaporiser l'éthanol à 70% dans la cartouche pour créer un environnement plus aseptique. Assurez-vous que l'éthanol a séché avant d'ajouter la solution d'impression bioink. 4. Faire Suspension Cell – «Biol'encre " Des cellules en culture avant d'être prêt au passage. Pour les fibroblastes 3T3: les cellules de semences sur flacons T-75 à environ 1.3×10 4 cellules / cm 2 dans Dulbeccos Eagles Medium mise à jour (DMEM) avec 10% sérum de veau foetal (FBS). Cellules de culture pour deux jours dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. Faire fluorescente solution mère g-actine à une concentration 50 pg / ml dans une solution tampon phosphate (PBS). Au passage des cellules. Pour les fibroblastes 3T3: Retirez le support de flacon et rincer deux fois avec du PBS. Couvrir les cellules avec 5 ml de trypsine 0,25% + EDTA et incuber pendant 5 minutes. Ajouter 5 ml de milieu frais et pipeter la suspension de cellules dans un tube de 15 ml à centrifuger conique et centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min. Aspirer passé à moyen terme. Remettre en suspension les cellules dans du PBS avec une solution fluorescente stocks g-actine pour créer bioink. Bioink doit avoir une concentration finale de g-actine de 10 ug / ml et une coopération cellulairencentration de 1×10 5 cellules / ml. Cette concentration a été optimisée pour limiter la quantité de cellules par goutte et le colmatage de la tête d'impression 8. Notez que 250 pi de bioink imprime trois lamelles avec le modèle illustré à la figure 2. 5. Bioprinting Mise en marche et laisser l'imprimante se réchauffer. Endroit désiré surface d'impression (ici, on utilise 22 mm x 22 mm lamelles) sur le centre de la scène préparée à l'étape 1.6. Créer un fichier de signatures de l'impression. Ouvrez Microsoft Word (ou tout autre logiciel de dessin), et dessiner le motif désiré. Choisissez un modèle d'impression souhaitée pour l'impression de cellules dans le fichier premade. Chargez la cartouche préparée avec suspension cellulaire désirée. La suspension de la pipette dans la circulaire de petits puits au fond du compartiment de la cartouche. Utilisez environ 100-120 ul de la solution. La taille des gouttes imprimés est d'environ 130picolitres. 8 Imprimer le fichier avec l'imprimante HP Deskjet 500 Imprimante. Pour de meilleurs résultats, imprimez les petits modèles à plusieurs reprises (5), en changeant le nombre de copies souhaitées dans le programme de traitement de texte. L'imprimante se réchauffer de nouveau, puis la cartouche se déplace vers la "position d'attente". Lorsque la cartouche se déplace dans la position d'attente (un peu à gauche de la goutte d'encre bien au-dessous et y reste), tirez sur le fil mécanisme d'alimentation papier et l'impression doit commencer. Pour obtenir des exemplaires multiples de l'impression, le mécanisme d'alimentation papier devront être remis en liberté après chaque cycle ou une page imprimée. La cartouche sera ensuite revenir à la position "prête", et le fil mécanisme d'alimentation papier doit être soulevée à nouveau. L'imprimante permet d'imprimer sur la lamelle placée au centre de l'étape d'impression à l'étape 5.2 (voir Figure 2). 6. Résultats représentatifs </ P> Les résultats représentatifs de l'ensemble de processus de conversion d'une norme, Deskjet hors du plateau-HP 500, standard cartouches HP de la série 26 va créer une imprimante avec la capacité d'imprimer des solutions cellulaires pour de nombreux types d'analyse comme indiqué précédemment. L'imprimante terminée après la conversion est représentée sur la figure 3, avec un étage d'impression afin de placer le couvercle de microscope sur glissement. L'imprimante peut être utile dans l'analyse dans de nombreux domaines, y compris mais non limité à: la mécanique des cellules simples, l'ingénierie tissulaire, transfection génique, micromodelage biocapteur et thérapies cellulaires directs 1-10, 16-22. Dans cet exemple, une imprimante HP Deskjet 500 imprimante HP et 26 cartouches d'encre de la série ont été modifiés pour bioprinting. En utilisant cette installation imprimante avec un bioink constituée d'une suspension cellulaire de fibroblastes dans une solution de monomère g-actine, les cellules ont été imprimés sur des lamelles de microscope en verre. La figure 1 illustre la chose représentatives PHP sous de cellules de fibroblastes imprimés, qui montrent incorporés monomères d'actine fluorescente. Les résultats ont été obtenus dans un environnement contrôlé aseptique dans lequel les cellules ont été imprimés dans des modèles personnalisables. Le modèle utilisé dans cet exemple a été créé dans Microsoft Word (Figure 2). Ce modèle a créé une ligne continue de la solution d'impression à travers la majorité de la lame de microscope. La figure 4 montre la ligne droite dans laquelle le bioink et les cellules sont mutuellement déposé. Il convient de noter que, immédiatement après l'impression, il ya une augmentation de la fluorescence de fond parce que la solution bioink, dans lequel les cellules sont suspendues, contient libres excédentaires monomères d'actine fluorescente. Cette fluorescence de fond diminue sensiblement après l'addition de milieu de croissance sur les cellules (figure 1), qui lave monomère excédentaire du substrat. ad/3681/3681fig1.jpg "/> Figure 1. Des images représentatives de fibroblastes 3T3 3 heures après l'impression en utilisant l'imprimante jet d'encre modifiées. L'intérieur des cellules montrent incorporés monomères d'actine marquées par fluorescence. Barres d'échelle représentent 50 um. Figure 2. De conception utilisées pour imprimer bioink. Figure 3. Imprimante après la conversion avec le stade de styromousse. Le fil orange au milieu contourne le capteur de levier d'alimentation papier. Figure 4. L'image représentant des fibroblastes 3T3 imprimés dans une zone d'impression localisée. Image en microscopie pris 5 minutes après l'impression à un grossissement de 20x. / Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg "/> Figure 5. Image de fluorescence (grossissement 40x) pris 3 heures après l'impression montrant un fibroblaste avec intériorisées monomères d'actine fluorescente. La barre d'échelle représente 50 um. Figure 6. Microscopie fluorescente (20x) de prise d'une cellule 15 minutes après l'impression. L'image montre à la fois g-actine (vert) et le noyau (en bleu). De gauche à droite: g-actine avec Alexa Fluor 488, noyau avec DAPI, et une superposition des deux. Figure 7. Microscopie à fluorescence montrant deux fibroblastes dans un modèle de ligne 3 heures après l'impression. Image à gauche montre monomères d'actine marqués par fluorescence à l'intérieur des cellules. Image sur la droite est une superposition du canal fluorescent avec l'image de fond pour montrer que, bien queil peut y avoir des débris sur la diapositive (en bas à gauche), il ne montre aucune fluorescence. Barres d'échelle représentent 50 um si la taille n'est pas indiquée à l'extrême droite est un groupe de contrôle de non-imprimés cellules incubées pendant 3 heures avec des monomères marquées par fluorescence. Ce contrôle est de montrer que les monomères ne pouvaient pas pénétrer la membrane cellulaire sans perméabilisation de la membrane cellulaire par l'impression.