Criando poros celulares transitórios membrana utilizando uma impressora jato de tinta padrão
Summary
Uma descrição dos métodos utilizados para converter uma HP DeskJet 500 impressora em um bioprinter. A impressora é capaz de processar as células vivas, o que provoca poros transientes na membrana. Estes poros pode ser utilizada para incorporar pequenas moléculas, incluindo fluorescente G-actina, para dentro das células impressas.
Abstract
Bioprinting tem uma vasta gama de aplicações e de significância, incluindo a engenharia de tecidos, as terapias de aplicação directa de células, e microfabricação biossensor. 1-10 Recentemente, a impressão a jacto de tinta térmica também tem sido utilizado para a transfecção de genes. 8,9 O processo de impressão a jacto de tinta térmica foi mostrado para interromper temporariamente as membranas celulares, sem afectar a viabilidade celular. Os poros transientes na membrana pode ser usada para introduzir moléculas, que de outra forma seriam demasiado grande para passar através da membrana, para o citoplasma da célula. 8,9,11
A aplicação a ser demonstrado aqui é o uso de impressão a jacto de tinta térmica para a incorporação de fluorescente etiquetado G-actina em células monómeros. A vantagem de utilizar a impressão por jacto de tinta térmica para injectar moléculas nas células é que a técnica é relativamente benigna para as células. 8, a viabilidade celular 12 após a impressão tem sido demonstrado ser semelhante ao padrão de células PLAting métodos 1,8. Além disso, a impressão a jacto de tinta pode processar milhares de células em minutos, que é muito mais rápido do que microinjecção manual. Os poros criados por impressão têm sido mostrados para fechar dentro de cerca de duas horas. No entanto, existe um limite para o tamanho do poro criado (~ 10 nm), com esta técnica de impressão, o que limita a técnica de injecção com células pequenas proteínas e / ou partículas. 8,9,11
Um padrão de HP DeskJet 500 impressora foi modificado para permitir a impressão célula. 3, 5, 8 A tampa da impressora foi removido eo mecanismo de alimentação de papel foi contornado usando uma alavanca mecânica. Um palco foi criado para permitir a colocação de lâminas de microscópio e lamínulas diretamente sob a cabeça de impressão. Os cartuchos de tinta foram abertos, a tinta foi removido e foram limpos antes da utilização com as células. O padrão de impressão foi criado usando o software de desenho padrão, que então controlava a impressora através de um comando de impressão simples. Fibro 3T3blastos foram cultivadas até à confluência, tripsinizadas e, em seguida ressuspensas em solução salina tamponada com fosfato com solúveis fluorescente etiquetado g de actina-monómeros. A suspensão de células foi pipetado para dentro do cartucho de tinta e as linhas de células foram impressas em lapsos de vidro de cobertura do microscópio. As células vivas foram fotografadas usando a microscopia de fluorescência e actina foi encontrado por todo o citoplasma. Incorporação de actina fluorescente para dentro da célula permite a criação de imagens de curto tempo dinâmica do citoesqueleto e é útil para uma vasta gama de aplicações. 13-15
Protocol
Discussion
O processo para converter uma impressora jato de tinta para desktop padrão bioprinting não é particularmente difícil. O passo mais difícil é determinar a forma de contornar o mecanismo de alimentação de papel, que é dependente da marca e modelo de impressora usado. No entanto, isso é relativamente simples quando o sensor de alimentação de papel é mecânico como descrito aqui. Para os modelos com sensores ópticos de alimentação, outras técnicas podem precisar de ser empregada para enganar a impressora em pensar que está usando papel, por exemplo, pode-se executar um pequeno pedaço de papel através da impressora, enquanto ele imprime na lâmina de microscópio. Ignorando o mecanismo de alimentação de papel é provável que seja o passo mais difícil na aplicação destes procedimentos para diferentes modelos de impressoras.
Ao construir uma fase para segurar as lamelas para impressão, é importante para garantir o alinhamento correcto ea altura. A fase deve permitir a lamela para ser colocado no meio da área de impressão. Além disso, deve-se plÁs lamela a uma altura adequada para permitir uma folga para o cartucho de tinta para passar sobre a lâmina sem interromper-lo. A altura exacta da fase dependerá do modelo da impressora.
Para assegurar que as células não são impressos lavados, as lâminas foram colocadas numa incubadora imediatamente após a impressão, durante aproximadamente 30 minutos para permitir a ligação de células antes de meios de crescimento adicionais de células foi adicionado. Como as células foram impressas em uma solução que inclui grandes quantidades de PBS as células não secar e permaneceu viável. As células foram visualizados utilizando microscopia de fluorescência para visualizar a distribuição dos etiquetados g de actina-monómeros dentro da célula (Figuras 1, 5-7). Quando a impressão com fibroblastos 3T3, a Figura 5 mostra um resultado representativo, com a actina causando muito da célula para fluorescência, mas mostrando linhas de brilho aumentado. A incorporação de fluorescentemente marcado g-actina no citoesqueleto éútil para o estudo da dinâmica do citoesqueleto e mecânicos celulares. 12-15 Uma limitação desta técnica é que ela só é aplicável para moléculas e proteínas que têm diâmetros menores do que cerca de 10 nm.
Para assegurar que as células foram realmente a ser processado pela impressora convertido, DAPI (1:5000 em PBS) foi adicionada à bioink no lugar de metade do volume de PBS puro. O DAPI fluorescente mancha liga-se a porções de aminoácidos ricas de DNA localizados no núcleo. Portanto DAPI é uma mancha útil na fluorescência núcleos das células de imagem impressos. A Figura 6 mostra uma imagem representativa de uma célula apresentando tanto Alexa Fluor 488 (actina) e DAPI de fluorescência (núcleo) com uma imagem de sobreposição de ambos. Figura 7 ilustra também como as células fluorescem uma vez que os monómeros de actina-g foram incorporadas enquanto não biológico material que foi depositado na amostra não fluorescência devido à absence de G-actina monómeros.
Uma consideração importante para bioprinting é os meios aquosos sendo usados para a bioink. Verificou-se que a utilização de meios de crescimento de células normais com soro produziu resultados inconsistentes. Isso é mais provável devido ao entupimento dos bicos da cabeça de impressão de proteínas séricas. A utilização de PBS aumentou a consistência de padrões impressos e do número de células depositadas. Uma desvantagem de usar PBS é que as células não deve ser deixado na suspensão por períodos prolongados de tempo. No entanto, fibroblastos em estes exemplos foram capazes de tolerar as condições bioink para pelo menos uma hora, sem qualquer alteração da viabilidade celular. Isto é consistente com várias conclusões anteriores, que relatam que as células impressas por meio de mecanismos de jacto de tinta térmicos têm sido demonstrado que têm taxas de viabilidade elevadas. 2-8
Esta configuração da impressora modificado pode ser utilizado para outras aplicações do que a impressão célula. 16-22 proteínas da matriz, tais como colagénio ou fibronectin, pode ser facilmente impressa sobre substratos com esta técnica, que pode ser útil para padronização célula. Por exemplo tipo de colagénio, I impresso em padrões de linhas irá resultar em substratos de colagénio alinhadas que podem ser utilizados em estudos de cultura in vitro de células. 17 Além das proteínas da matriz, outras moléculas, incluindo factores de crescimento, pode ser fiavelmente localizada sobre substratos para estudos de células e potenciais aplicações terapêuticas. de 18
Uma limitação importante na concepção do descrito nas etapas acima é que esta impressora não é capaz de imprimir em mais de uma dimensão. Isto limita o potencial para a utilização em aplicações tais como a impressão estampados andaime. Para permitir a impressão em 3D, uma fase especializado precisa de ser utilizado. O estágio precisa ter ajustes de altura incrementais para camada por camada, deposição de bioink.
Bioprinting mostrou a promessa como um método eficiente e custo-eficaz para a engenharia de tecidos, Fabricação gene micropatterning transfecção e microarray 1-12, 16-22 As aplicações futuras deste tipo de dispositivo são numerosos, incluindo:. Criação de controlados e padronizados microambientes celulares, incorporação de macromoléculas no citoplasma da célula, e deposição de células para andaimes e estruturas que não ocorrem naturalmente ou de forma eficiente.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer o Dr. Thomas Boland para a idéia de usar as impressoras HP Deskjet para impressão célula. O financiamento para este projeto da NSF RII-EPS 0903795 e NIH K25 HL0922280.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| HP DeskJet 500 | Hewlett-Packard | C2106A | Discontinued from manufacturer. Purchased refurbished DEC Trader. |
| HP 26 Black Ink Cartridge | Hewlett-Packard | 51626A | |
| Actin from rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate, 200 μg | Invitrogen | A12373 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | ICN1860454 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3002201 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco | VLF 797 | Optional housing for keeping printer aseptic |
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