خلق عابر المسامات غشاء الخلية باستخدام طابعة نافثة للحبر القياسية
Summary
وصفا للأساليب المستخدمة لتحويل منضدية HP 500 الطابعة إلى bioprinter. الطابعة غير قادرة على معالجة الخلايا الحية، والذي يسبب مسام عابرة في غشاء. ويمكن استخدام هذه المسام لدمج الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك فلوري G-الأكتين، إلى خلايا المطبوعة.
Abstract
Bioprinting لديها مجموعة واسعة من التطبيقات وأهميتها، بما في ذلك هندسة الأنسجة، ومباشرة تطبيق علاجات الخلية، وmicrofabrication جهاز الاستشعار البيولوجي. 1-10 في الآونة الأخيرة، كما تم الحرارية الطباعة النافثة للحبر تستخدم لترنسفكأيشن الجينات. 8،9 والطباعة النافثة للحبر الحرارية عملية تبين لل تعطيل مؤقتا في أغشية الخلايا دون التأثير على بقاء الخلية. ويمكن استخدام مسام عابرة في غشاء لتقديم الجزيئات، والتي من شأنها أن يكون الأمر خلاف ذلك كبيرة جدا لتمر عبر الغشاء، في سيتوبلازم الخلية. 8،9،11
التطبيق يتم شرحها هنا هو استخدام الطباعة النافثة للحبر الحرارية لدمج مونومرات G-الأكتين fluorescently المسمى في الخلايا. وميزة استخدام الحرارية نافثة للحبر الطباعة لحقن الجزيئات في الخلايا هو أن التقنية هي حميدة نسبيا للخلايا. وقد تبين 8، بقاء الخلية 12 بعد الطباعة لتكون مماثلة لجيش التحرير الشعبى الصينى الخلية القياسيةطرق تينغ 1،8. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الطباعة النافثة للحبر معالجة الآلاف من الخلايا في غضون دقائق، وهو أسرع بكثير من microinjection دليل. وقد ثبت أن المسام التي أنشأتها الطباعة ليغلق في غضون ساعتين تقريبا. ومع ذلك، هناك حد لحجم المسام خلق (~ 10 نانومتر) مع هذا الأسلوب والطباعة، الأمر الذي يحد من تقنية لحقن الخلايا مع البروتينات الصغيرة و / أو جزيئات. 8،9،11
تم تعديل معيار HP DESKJET 500 الطابعة للسماح للطباعة الخلية. 3، 5، 8 غطاء الطابعة تم إزالة وآلية تغذية الورق وتجاوز استخدام رافعة ميكانيكية. تم إنشاء المرحلة للسماح لوضع الشرائح المجهر وcoverslips مباشرة تحت رأس الطباعة. فتحت خراطيش الحبر، وتمت إزالة الحبر وتم تنظيفها قبل استخدامها مع الخلايا. تم إنشاء نمط الطباعة باستخدام معيار برامج الرسم، والتي تسيطر وقتها على الطابعة من خلال أمر الطباعة بسيط. 3T3 الليفيوقد نمت الانفجارات إلى نقطة التقاء، trypsinized، ومعلق ثم في الفوسفات مخزنة المالحة مع ذوبان مونومرات G-الأكتين fluorescently المسمى. وكان pipetted تعليق خلية في خرطوشة الحبر وطبعت خطوط من الخلايا على زلات غطاء زجاجي المجهر. تم تصوير الخلايا الحية باستخدام المجهر مضان وعثر الأكتين في جميع أنحاء السيتوبلازم. إدماج الأكتين فلوري في الخلية يسمح للتصوير من لوقت قصير ديناميات هيكل الخلية وغير مفيدة لطائفة واسعة من التطبيقات. 13-15
Protocol
Discussion
عملية لتحويل سطح المكتب القياسية النافثة للحبر الطابعة لbioprinting ليست صعبة للغاية. الخطوة الأكثر تحديا هو تحديد كيفية تجاوز آلية تغذية الورق، والتي تعتمد على نوع وطراز الطابعة المستخدمة. ومع ذلك، وهذا هو بسيط نسبيا عند استشعار تغذية الورقة الميكانيكية كما هو موضح هنا. لنماذج مع أجهزة الاستشعار البصرية تغذية، قد تحتاج إلى غيرها من التقنيات التي ستستخدم لخداع الطابعة إلى التفكير في أنه يستخدم ورقة، على سبيل المثال، يمكن للمرء أن تشغيل قطعة صغيرة من الورق من خلال الطابعة في الوقت الذي يطبع على الشريحة المجهر. تجاوز آلية تغذية الورق من المرجح أن تكون الخطوة الأكثر صعوبة في تطبيق هذه الإجراءات على النماذج طابعة مختلفة.
عند بناء مرحلة لعقد coverslips للطباعة، فمن المهم لضمان التوافق السليم وارتفاع. وينبغي في مرحلة تسمح ساترة لتوضع في وسط منطقة الطباعة. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي له ررالآس وساترة في 1 ارتفاع كاف للسماح لإزالة خرطوشة الطباعة لتمرير أكثر من الشريحة دون تعطيل ذلك. فإن ارتفاع الدقيق للمرحلة تعتمد على طراز الطابعة.
للتأكد من أن لا تحصل خلايا المطبوعة جرفت، وضعت الشرائح في حاضنة مباشرة بعد الطباعة لمدة 30 دقيقة تقريبا للسماح لمرفق الخلية قبل أضيف إضافية وسائل الاعلام في نمو الخلايا. لأنه تم طبع الخلايا في التوصل إلى حل يتضمن كميات كبيرة من الخلايا في برنامج تلفزيوني لم تجف، وظلت قادرة على البقاء. تم تصوير الخلايا باستخدام المجهر مضان لتصور توزيع مونومرات G-الأكتين المفتاحية داخل الخلية (أرقام 1، 5-7). عند الطباعة مع الخلايا الليفية 3T3، ويبين الشكل 5 نتيجة ممثل، مع الأكتين يسبب الكثير من الخلايا ليتألق، ولكن تعرض خطوط سطوع المتزايدة. إدماج الموسومة fluorescently G-الأكتين في الهيكل الخلوي هومفيدة لدراسة ديناميات هيكل الخلية وميكانيكا الخلوية. 12-15 وجود قيود من هذا الأسلوب هو أنه لا ينطبق إلا لجزيئات البروتينات، والتي لديها ما يقرب من أقطار أصغر من 10 نانومتر.
لضمان والواقع أن الخلايا التي يتم معالجتها بواسطة الطابعة تحويلها، وأضيف دابي (1:5000 في PBS) إلى bioink في مكان من نصف حجم برنامج تلفزيوني محض. ودابي فلوري وصمة عار بربط أجزاء من الأحماض الأمينية الغنية من الحمض النووي الموجود في نواة. ولذلك دابي وصمة مفيدة في نوى التصوير fluorescently من الخلايا المطبوعة. ويبين الشكل 6 صورة ممثل خلية عرض على حد سواء اليكسا فلور 488 (الأكتين) ودابي (نواة) مضان مع صورة تراكب على حد سواء. الشكل 7 يوضح أيضا كيف والخلايا يتألق مرة واحدة تم فيها دمج مونومرات G-الأكتين في حين غير البيولوجية المادية التي أودعت في العينة لن يتألق بسبب absenc(ه) من G-الأكتين مونومرات.
أحد الاعتبارات المهمة لbioprinting هو الوسط المائي تستخدم لbioink. وحيث تبين ان وسائل الاعلام باستخدام معيار نمو الخلايا مع المصل أسفرت عن نتائج غير متسقة. وهذا هو الأرجح بسبب انسداد فتحات الطباعة الرأس بواسطة بروتينات مصل الدم. زيادة استخدام برنامج تلفزيوني اتساق أنماط المطبوعة وأودع عدد من الخلايا. عيب واحد لاستخدام برنامج تلفزيوني أنه لا ينبغي أن تترك الخلايا في التعليق لفترات طويلة من الزمن. ومع ذلك، كانت الخلايا الليفية في هذه الأمثلة قادرة على تحمل الظروف bioink لمدة ساعة على الأقل مع عدم وجود تغيير في بقاء الخلية. وهذا يتفق مع النتائج قبل عدة، والتي تفيد بأن ثبت الخلايا طباعتها من خلال آليات نفث الحبر الحرارية لديها معدلات عالية الجدوى. 2-8
ويمكن استخدام هذا إعداد الطابعة تعديل لتطبيقات أخرى من الطباعة الخلية. البروتينات مصفوفة 16-22، مثل الكولاجين أو fibronectin، يمكن طباعتها بسهولة على ركائز مع هذه التقنية، التي يمكن أن تكون مفيدة لتنميط الخلية. لنوع المثال الكولاجين، وأنا المطبوعة في أنماط الخط سيؤدي إلى ركائز الكولاجين الانحياز التي يمكن استخدامها لمدة 17. في الدراسات المختبرية ثقافة خلية بالإضافة إلى مصفوفة من البروتينات، والجزيئات الأخرى، بما فيها عوامل النمو، ويمكن ترجمة بشكل صحيح على ركائز للدراسات الخلية والعلاجية التطبيقات المحتملة. 18
وجود قيود الرئيسية للتصميم هو موضح في الخطوات المذكورة أعلاه هو أن هذه الطابعة غير قادر على الطباعة في أكثر من بعد واحد. وهذا يحد من إمكانية للاستخدام في التطبيقات مثل نمط الطباعة سقالة. للسماح للطباعة 3D، والمتخصصة في مرحلة تحتاج لاستخدامه. المرحلة يحتاج الى تعديلات ارتفاع تدريجي للطبقة تلو طبقة ترسب bioink.
وقد أظهرت Bioprinting وعد كطريقة فعالة وفعالة من حيث التكلفة لهندسة الأنسجة، الجينات ترنسفكأيشن، micropatterning وميكروأري تلفيق 1-12، 16-22 والتطبيقات المستقبلية لهذا النوع من جهاز عديدة، بما في ذلك:. خلق microenvironments الخلوية تسيطر عليها ومنقوشة، دمج الجزيئات في السيتوبلازم الخلية، وترسب الخلايا على السقالات والهياكل التي لا تحدث بصورة طبيعية أو كفاءة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب يود أن يقر الدكتور توماس بولاند لفكرة استخدام طابعات منضدية HP للطباعة الخلية. تمويل هذا المشروع من جبهة الخلاص الوطني RII-EPS 0903795 والمعاهد الوطنية للصحة K25 HL0922280.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| HP DeskJet 500 | Hewlett-Packard | C2106A | Discontinued from manufacturer. Purchased refurbished DEC Trader. |
| HP 26 Black Ink Cartridge | Hewlett-Packard | 51626A | |
| Actin from rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate, 200 μg | Invitrogen | A12373 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | ICN1860454 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3002201 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco | VLF 797 | Optional housing for keeping printer aseptic |
References
- Calvert, P. Materials science. Printing cells. Science. 318, 208-209 (2007).
- Mironov, V., Reis, ., Derby, B. Review: Bioprinting: A beginning. Tissue Eng. 12, 631-634 (2006).
- Pepper, M. E., Parzel, C. A., Burg, T., Boland, T., Burg, K. J. L., Groff, R. E. Design and Implementation of a two-dimensional inkjet bioprinter. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 3-6, 6001-6005 (2009).
- Campbell, P., Weiss, L. Tissue engineering with the aid of inkjet printers. Expert Opin. Biol. Th. 7, 1123-1127 (2007).
- Boland, T., Xu, T., Damon, B., Cui, X. Application of inkjet printing to tissue engineering. Biotechnol. J. 1, 910-917 (2006).
- Mironov, V., Prestwich, G., Forgacs, G. Bioprinting Living Structures. J. Mater. Chem. 17, 2054-2060 (2007).
- Xu, T., Rohozinski, J., Zhao, W., Moorefield, E. C., Atala, A., Yoo, J. J. Inkjet-mediated gene transfection into living cells combined with targeted delivery. Tissue Eng. Part A. 15, 95-101 (2009).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z., Boland, T. Cell Damage Evaluation of Thermal Inkjet Printed Chinese Hamster Ovary Cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Saunders, R., Derby, B. B. i. o. p. r. i. n. t. i. n. g. Inkjet Deposition. Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology. 15, (2010).
- Prabha, S., Zhou, W., Panyam, J., Labhasetwar, V. Size-dependency of nanoparticle mediated gene transfection: studies with fractioned nanoparticles. Int. J. Pharm. 244, 105-115 (2002).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Apodaca, G. Endocytic Traffic in Polarized Epithelial Cells: Role of Actin and microtubule Cytoskeleton. Traffic. 2, 149-159 (2001).
- Hotulainen, P., Llano, O., Smirnov, S., Tanhuanpää, K., Faix, G., Rivera, C., Lappalainen, P. Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis. J. Cell Biol. 185, 323-339 (2009).
- Allen, P. G. Actin filament uncapping localizes to ruffling lamellaw and rocketing vesicles. Nat Cell Biol. 5, 972-979 (2003).
- Cooper, G. M., Miller, E. D., Desesare, G. E., Usas, A., Lensie, E. L., Bykowski, M. R., Huard, J., Weiss, L. E., Losee, J. E., Campbell, P. G. Inkjet-based biopatterning of bone morphogenetic protein-2 to spatially control calvarial bone formation. Tissue Eng. Part A. 16, 1749-1759 (2010).
- Deitch, S., Kunkle, C., Cui, X., Boland, T., Dean, D. Collagen matrix alignment using inkjet printer technology. Proc. 1094 (DD. , 7-16 (2008).
- Ilkhanizadeh, S., Teixeira, A., Hermanson, O. Inkjet printing of macromolecules on hydrogels to steer neural stem cell differentiation. Biomaterials. 28, 3936-3943 (2007).
- Ringeisen, B. R., Orthon, C. M., Barron, J. A., Young, D., Sparago, B. J. Jet-based methods to print living cells. Biotechnol. J. 1, 930-948 (2006).
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260, 920-926 (1993).
- Okamoto, T., Suzuki, T., Yamamoto, N. Microarray fabrication with covalent attatchment of DNA using Bubble Jet technology. Nature Biotechnol. 18, 438-441 (2000).
