標準的なインクジェットプリンタを使用して一時的な細胞膜孔を作成する

1。のHP DeskJet 500を変換するこれは、この手法は多くの市販のインクジェットプリンタで動作するべきであることに注意する必要があります。ただし、古いプリンタでは、彼らが同じように簡単に詰まらせていない大径ノズルとインクカートリッジを使用しており、良い仕事する傾向があります。さらに、古いプリンタにはバイパスが容易である機械的な給紙センサーを使用する傾向があります。オプティカルセンサーを搭載したプリンタがだまされますが、各サイクル中にプリンタの遠端に紙の小片を使用していますが、 "トリック"への機械的なシステムよりも少し困難であることができます。最高の仕事は、現在市販されているプリンタは、低解像度（DPI）を持っています。 高解像度のプリンタでは、より簡単に詰まらせる傾向があります。のHP Deskjet 500の解像度は300 dpiです。 600 DPIの解像度を持っている多くの市販のプリンタ（HP DeskJetのシリーズなど）があります。このタイプのプリンタは、ノズルのわずかな増加に伴って使用することができます（セクション3）慎重にクリーニングを使用して軽減することができる問題を目詰まり。 プリンタの底部基地から、いくつかのプラスチック製のクリップのロックを解除し、ゆっくりと上部をオフに持ち上げてプリンタ上部のプラスチックケースを削除します。 を外し、ボタン/プリンタの上部からの光パネルを表示し、それはプリンタのマザーボードに接続したまま。 特に、プリンタの内部に、インクカートリッジがかかっていると印刷が発生した領域を清掃してください。 紙送り機構に電力を供給するケーブルを見つけて、マザーボードからそれらのプラグを抜きます。 はHP DeskJet 500で、これらはちょうど正面の左側に向かって給紙トレイの下に発見された。 紙の検出メカニズムを見つけます。手動プルハンドルとして機能する文字列やワイヤループを貼り付けるためのメカニズムをバイパスしてください。 はHP DeskJet 500で、紙の検出機構は、印刷/紙送り機構の上と後ろに見つかった灰色のプラスチック製のレバーです。 ただカートリッジのプリントヘッドの下のレベルに所望の印刷スライドを実現するための紙送り機構（用紙はから供給され、堆積される場所）の前にステージを作成します。 私たちの実験のために、15 mLの遠心分離管の泡の出荷ホルダーは、所望の高さにスライドの最終レベルをもたらすために、印刷領域内の場所で録音し、いくつかの顕微鏡スライドを使用しました。 無菌性を維持するために、プリンタは、標準的なバイオハザードキャビネットまたは卓上層流フードの内側に配置することができます。 市販のインクジェットプリンタを変更すると、通常のプリンタのメーカー保証が無効になりますことに注意することは重要です。 2。変換証券HPインクカートリッジ（HP 26ブラックインクカートリッジ） 当分の間、プリンタの連絡先やプリントヘッドを覆っている保護テープを残して、そのパッケージからカートリッジを取り外します。 体を安定させるクランプまたは万力（単にしっかりと通常同様に働いて手でカートリッジをつかんで）のいずれかのカートリッジ（黒部分）の、いずれかの障害の緑の上を明確に残します。 ペンチやモンキーレンチを使用して、カートリッジの緑色の上部をつかみ、それを自由に中断するまで、前後に数回ねじります。 これは非常に力を取るべきではありませんが、上部は必要なくなったので、それを削除するとき、それが起これば、それは大丈夫です。 ドライバーを使用して、現在露出した透明なプラスチック部分を無理に外そう。 繰り返しますが、これは非常に力を取るべきではありませんが、それは必要なされませんので、取り外しの際に壊れたときにそれは大丈夫です。 貯水池から残りを空にします。 プリンタの連絡先やプリントヘッドを覆っているビニールの保護テープを取り外します。 徹底的に水で貯水池をフラッシュします。 チャネルを介して水をプッシュするピペットまたはシリンジを使用しています。 水の可能性が高い時に印字ヘッドから漏れます。このプロセスは、これは許容範囲内で、カートリッジの機能に損傷を与えることはありません。 水がきれいに実行すると、カートリッジが乾燥することができます。 3。インクカートリッジのクリーニングきれいな印刷環境を維持するために、インクカートリッジは使用前と使用後に洗浄する必要があります。 これは、閉塞を引き起こす可能性がカートリッジ内に塩及びその他の生物材料の結晶化を回避に役立ちます。 完全に水没脱イオン水を完全にビーカー内のカートリッジ、印刷前と後の15分間超音波洗浄します。 超音波処理した後、水からカートリッジを取り出し、余分な水を振る。 より多くの無菌環境を作成するためのカートリッジに70％エタノールをスプレーします。 エタノールはbioink印刷ソリューションを追加する前に乾燥していることを確認します。 4。細胞懸濁液を作る – "バイオインク " 通路に準備ができるまで培養細胞。 10％ウシ胎児血清（FBS）とDulbeccos改変イーグル培地（DMEM）で約1.3×10 4細胞/ cm 2でT-75フラスコにシード細胞：3T3線維芽細胞のために。 37℃インキュベーターで2日間培養細胞℃、5％CO 2。 リン酸緩衝液（PBS）中の濃度を50μg/ mlの蛍光G-アクチンのストック溶液を作成します。 継代細胞。 3T3線維芽細胞の場合：フラスコから培地を取り除き、PBSで2回すすいでください。 5分のために5ミリリットル、0.25％トリプシン+ EDTAとインキュベートした細胞をカバーしています。 新鮮培地5mlを加え、5分間1000rpmで15 mlコニカル遠心チューブと遠心分離機に細胞懸濁液をピペットで。吸引は、媒体を過ごしました。 bioinkを作成するために蛍光灯G-アクチンのストック溶液をPBSで細胞を再懸濁します。 Bioinkは10μg/ mlのG-アクチンの最終濃度と細胞の共同が必要です1×10 5細胞/ mlのncentration。この濃度は、プリンタヘッドのドロップすると、目詰まりあたりのセルの量を制限するために最適化されています。8 bioink250μlの図2に示すパターンを持つ3つのカバースリップを出力することに注意してください。 5。 Bioprinting の電源をオンにして、プリンタがウォームアップしましょう​​。 ステップ1.6で調製したステージの中央の上に置き、目的の印刷面（ここでは、我々は22ミリメートル×22 mmのカバーガラスを使用します）。 印刷パターンファイルを作成します。 開いているMicrosoft Word（または他の描画ソフトウェア）、および所望のパターンを描画します。 既成のファイル内のセルの印刷の所望の印刷パターンを選択します。 所望の細胞懸濁液を調製したカートリッジをロードします。 よくカートリッジのコンパートメントの下部にある小さな円形のピペットの懸濁液。溶液を約100から120μlを使用しています。印刷された液滴サイズは130程度であるピコ8。 HP DeskJet 500プリンタを使用してファイルを印刷します。 最良の結果を得るには、ワードプロセッシングプログラムで希望するコピーの量を変化させることにより、より小さなパターンを複数回（5）を印刷します。 プリンタが再びウォームアップされ、次にカートリッジは "レディポジション"に移動します。 カートリッジの準備が位置（わずかに下回ったインク滴の左側に、そこに留まる）に移動したとき、紙送り機構のワイヤ上でプルアップし、印刷は開始すべきである。 印刷の複数のコピーを、紙送り機構は、毎サイクル、またはページが印刷された後に解放する必要があります。カートリッジは、 "準備完了"の位置に戻りますと、紙送り機構のワイヤが再び提起されるべきである。 プリンタが（ 図2を参照）、ステップ5.2での印刷ステージの中央に置かカバースリップの上に印刷されます。 6。代表的な結果</ P> 標準的な既製のHP Deskjet 500の全体の変換プロセスの代表的な結果は、標準のHP 26シリーズカートリッジは、前に述べたように分析の多くの種類のセル·ソリューションの印刷機能を持つプリンタを作成します。変換後の完了したプリンタは、顕微鏡カバースリップの上に配置し、印刷段階で、 図3に示されています。プリンタは、次のような多くの分野での分析に有用であるが、これらに限定することはできません。単一細胞力学、組織工学、遺伝子導入、バイオセンサー微細、直接細胞療法1-10、16から22。 この例では、HP DeskJet 500プリンタおよびHP 26シリーズのインクカートリッジはbioprintingために変更されました。 G-アクチンモノマー溶液中で線維芽細胞懸濁液から成るbioink、このプリンタのセットアップを使用して、細胞をガラス顕微鏡カバースリップ上に印刷された。 図1は、代表的な解像度を示しています組み込まれた蛍光アクチン単量体を示すプリント繊維芽細胞のults、。結果は、細胞がカスタマイズ可能なパターンに印刷された制御された無菌環境下で得られた。 この例で使用されるパターンは、Microsoft Word（ 図2）で作成されました。このパターンは、顕微鏡スライドの大半にわたって印刷ソリューションの連続線を作成しました。 図4は bioinkと細胞が相互に堆積された直線を示しています。それは細胞が中断されているbioinkソリューションは、無料の過剰蛍光アクチン単量体を含んでいるため、すぐに印刷した後、バックグラウンド蛍光の増加があることに留意すべきである。このバックグラウンド蛍光が大幅に基板から過剰のモノマーを洗浄細胞（ 図1）、上に増殖培地を添加した後に減少します。 ad/3681/3681fig1.jpg "/> 図1：3時間変更されたインクジェットプリンタを使用して印刷した後、3T3線維芽細胞の代表的な画像。細胞の内部には組み込まれ蛍光標識アクチン単量体を示しています。スケールバーは50μmを表す。 図2デザインbioinkを印刷するために使用されます。 図3。発泡スチロール段と変換後のプリンタ。中央のオレンジ色の線は、紙送りレバーセンサーをバイパスします。 図4。ローカライズされた印刷ゾーンで印刷3T3線維芽細胞の代表的なイメージ。顕微鏡画像は、20倍の倍率で印刷した後、5分を撮影。 / files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg "/> 図5：3時間内在蛍光アクチン単量体と線維芽細胞を示す印刷後に撮影した蛍光画像（40×倍率）。スケールバーは50μmを表す。 図6 15分の印刷後に採取細胞の蛍光顕微鏡（20倍の倍率）。画像はG-アクチン（緑）、核（青）の両方を示しています。左から右へ：G-アクチンのAlexa Fluor 488、核DAPI、両方のオーバーレイである。 図7。3時間、印刷後にラインパターンの2つの線維芽細胞を示す蛍光顕微鏡。左の画像は、細胞内の蛍光標識アクチン単量体を示しています。右の画像は、表示する背景画像と蛍光チャンネルのオーバーレイですが、ここではそのスライド（左下隅）のいくつかの破片があるかもしれません、それは蛍光を発することはありません。サイズは一番右が蛍光標識モノマーで3時間インキュベートした非印刷のセルのコントロール群であることが示されていない場合のスケールバーは50μmを表す。このコントロールは、単量体は、細胞印刷で膜透過せずに細胞膜を貫通することができなかったことを示すことである。