Creazione transitori pori della membrana cellulare utilizzando una stampante a getto d'inchiostro standard
Summary
Una descrizione dei metodi utilizzati per convertire un HP DeskJet 500 stampante in un bioprinter. La stampante è in grado di elaborare le cellule viventi, che provoca transitori pori nella membrana. Questi pori possono essere utilizzati per incorporare piccole molecole, tra cui fluorescente G-actina e nelle cellule stampati.
Abstract
Bioprinting ha una vasta gamma di applicazioni e di significato, compresa l'ingegneria tessutale, terapie dirette applicazione di cellule e microfabbricazione biosensore. 1-10 Recentemente, la stampa a getto d'inchiostro termico è stato utilizzato anche per la trasfezione genica. 8,9 Il processo di stampa termica a getto d'inchiostro è stato dimostrato che temporaneamente interrompere le membrane cellulari senza compromettere la vitalità cellulare. I pori transitori della membrana può essere utilizzato per introdurre molecole, che altrimenti sarebbero troppo grande per passare attraverso la membrana, nel citoplasma cellulare. 8,9,11
L'applicazione viene mostrato qui è l'uso di stampa a getto d'inchiostro termica per l'incorporazione di fluorescente g-actina monomeri in cellule. Il vantaggio di utilizzare termica a getto di inchiostro per iniettare molecole nelle cellule è che la tecnica è relativamente benigna alle cellule. 8, 12 La vitalità cellulare dopo che la stampa è stata dimostrata simile alla cella PLA normaMetodi Ting 1,8. Inoltre, stampa a getto d'inchiostro in grado di elaborare migliaia di cellule in pochi minuti, che è molto più veloce microiniezione manuale. I pori creati dalla stampa hanno dimostrato di chiudere entro circa due ore. Tuttavia, esiste un limite alla dimensione del poro creato (~ 10 nm) con questa tecnica di stampa, che limita la tecnica di iniezione di cellule con piccole proteine e / o particelle. 8,9,11
Uno standard HP DeskJet 500 stampante è stato modificato per consentire la stampa cella. 3, 5, 8 Il coperchio della stampante è stato rimosso e il meccanismo di alimentazione della carta è bypassato mediante una leva meccanica. Una fase è stata creata per consentire il posizionamento di vetrini da microscopio e vetrini coprioggetti direttamente sotto la testina di stampa. Cartucce d'inchiostro sono stati aperti, l'inchiostro è stato rimosso e sono stati ripuliti prima dell'uso con le cellule. Il modello di stampa è stato creato con software standard di disegno, che poi controllato la stampante tramite un semplice comando di stampa. 3T3 fibroblasti sono state coltivate a confluenza, tripsinizzate, e quindi risospese in soluzione salina tamponata con fosfato solubili fluorescente g-actina monomeri. La sospensione cellulare è stata pipettano nella cartuccia d'inchiostro e linee di cellule sono state stampate su scivola microscopio in vetro di copertura. Le cellule vive sono stati ripresi utilizzando microscopia a fluorescenza e actina è stata trovata nel citoplasma. L'incorporazione di actina fluorescente nella cella permette l'imaging di dinamica citoscheletrici breve tempo ed è utile per una vasta gamma di applicazioni. 13-15
Protocol
Discussion
Il processo di convertire un normale stampante a getto d'inchiostro per bioprinting non è particolarmente difficile. Il passo più difficile è determinare il modo per bypassare il meccanismo di alimentazione della carta, che dipende dalla marca e il modello della stampante utilizzata. Tuttavia, questo è relativamente semplice, quando il sensore alimentazione carta è di tipo meccanico come qui descritto. Per i modelli con sensori ottici di alimentazione, altre tecniche potrebbe essere necessario essere impiegati per ingannare la stampante a pensare che sta usando la carta, per esempio, si può eseguire un piccolo pezzo di carta attraverso la stampante durante la stampa sul vetrino da microscopio. Bypassare il meccanismo di alimentazione della carta è probabilmente il passo più difficile l'applicazione di tali procedure per differenti modelli di stampante.
Quando si realizza uno stadio per contenere i coprioggetti per la stampa, è importante assicurare un corretto allineamento e altezza. La fase dovrebbe consentire la coprioggetto da essere collocato al centro dell'area di stampa. Inoltre, dovrebbe place del vetrino ad una altezza sufficiente per permettere l'autorizzazione per la cartuccia di stampa a passare alla diapositiva, senza turbarlo. L'altezza esatta della fase dipenderà dal modello di stampante.
Per assicurare che le cellule stampati non viene lavato via, i vetrini sono stati posti in un incubatore immediatamente dopo la stampa per circa 30 minuti per permettere l'adesione delle cellule prima di ulteriori mezzi di crescita delle cellule è stato aggiunto. Poiché le cellule sono state stampate in una soluzione che contiene grandi quantità di PBS delle cellule non seccano e rimasti vitali. Le cellule sono state ripreso utilizzando microscopia a fluorescenza per visualizzare la distribuzione dei tag g-actina monomeri all'interno della cella (figure 1, 5-7). Quando si stampa con fibroblasti 3T3, la figura 5 mostra un risultato rappresentativo, con l'actina causando gran parte della cella di fluorescenza, ma mostra linee di maggiore luminosità. L'incorporazione di fluorescenza con tag g-actina nel citoscheletro èutile per lo studio della dinamica citoscheletrici e meccanica cellulari. 12-15 Un limite di questa tecnica è che è applicabile solo per le molecole e proteine che hanno diametri inferiori a circa 10 nm.
Per garantire che le cellule sono state effettivamente elaborato dalla stampante convertito, DAPI (1:5000 in PBS) è stato aggiunto al bioink in luogo della metà del volume di PBS puro. Il colorante fluorescente DAPI lega a porzioni di amminoacidi ricchi di DNA che si trova nel nucleo. Pertanto DAPI è utile in una macchia fluorescente nuclei delle cellule immagini stampate. Figura 6 mostra una immagine rappresentativa di una cella di visualizzazione sia Fluor Alexa 488 (actina) e DAPI (nucleo) fluorescenza con un'immagine sovrapposizione di entrambi. Figura 7 illustra anche come le cellule fluorescenza quando le g-actina monomeri sono stati inseriti, mentre non materiale biologico che è stato depositato nel campione non emette fluorescenza a causa del absence g-actina di monomeri.
Una considerazione importante per bioprinting è il mezzo acquoso e utilizzate per bioink. Si è riscontrato che l'uso di normali mezzi di crescita delle cellule con il siero prodotto risultati inconsistenti. Ciò è probabilmente dovuto a intasamento delle ugelli della testina di stampa da parte di proteine del siero. L'uso di PBS aumentato la consistenza di motivi stampati e il numero di cellule depositato. Uno svantaggio dell'utilizzo PBS è che le cellule non dovrebbe essere lasciato in sospensione per periodi di tempo prolungati. Tuttavia, fibroblasti in questi esempi sono stati in grado di tollerare le condizioni bioink per almeno un'ora senza modifica vitalità cellulare. Ciò è coerente con diversi ritrovamenti precedenti, che riportano stampati che le cellule con meccanismi a getto d'inchiostro termico hanno dimostrato di avere tassi di redditività elevati. 2-8
Questa configurazione della stampante modificato potrà essere utilizzato per applicazioni diverse da stampa cell. 16-22 proteine della matrice, come il collagene o fibronectin, possono essere facilmente stampati su substrati con questa tecnica, che può essere utile per patterning cella. Ad esempio, collagene di tipo I stampato in modelli di linea si tradurrà in substrati collagene allineati che possono essere utilizzati per studi in vitro hanno. 17 Oltre alle proteine della matrice, molecole, compresi fattori di crescita, può essere localizzato in modo affidabile su substrati per studi cellulari e potenziali applicazioni terapeutiche 18.
Una limitazione importante della progettazione descritta nei passaggi precedenti è che la stampante non è in grado di stampare in più di una dimensione. Questo limita la possibilità di utilizzo in applicazioni modellate come la stampa scaffold. Per consentire la stampa 3D, una fase specializzato deve essere usato. La fase deve avere regolazioni in altezza incrementali per layer-by-layer deposizione di bioink.
Bioprinting ha mostrato risultati promettenti come un metodo efficace e conveniente per l'ingegneria tissutale, Gene trasfezione, micropatterning e microarray fabbricazione 1-12, 16-22 Le applicazioni future di questo tipo di dispositivo sono molteplici, tra cui:. Creazione di controllate e modellata microambienti cellulari, l'incorporazione di macromolecole nel citoplasma delle cellule, e deposizione di cellule su ponteggi e strutture che non presenti in natura o in modo efficiente.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Thomas Boland per l'idea di utilizzare le stampanti HP DeskJet per la stampa delle cellule. Il finanziamento per questo progetto da NSF RII-EPS 0903795 e NIH K25 HL0922280.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| HP DeskJet 500 | Hewlett-Packard | C2106A | Discontinued from manufacturer. Purchased refurbished DEC Trader. |
| HP 26 Black Ink Cartridge | Hewlett-Packard | 51626A | |
| Actin from rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate, 200 μg | Invitrogen | A12373 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | ICN1860454 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3002201 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco | VLF 797 | Optional housing for keeping printer aseptic |
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