יצירת חולף קרום התא הנקבוביות באמצעות מדפסת הזרקת דיו רגילה
Summary
תיאור של שיטות להמיר HP DeskJet 500 המדפסת לתוך bioprinter. המדפסת מסוגלת עיבוד תאים חיים, מה שגורם הנקבוביות חולפים על הממברנה. נקבוביות אלה יכול להיות מנוצל לשלב מולקולות קטנות, כולל ניאון G-אקטין, לתוך תאים מודפסים.
Abstract
Bioprinting יש מגוון רחב של יישומים ומשמעותם, כולל הנדסת רקמות, טיפולים ישירים יישומים סלולריים, microfabrication biosensor. 1-10 לאחרונה, הדפסה הזרקת דיו תרמית שימש גם עבור transfection הגן. 8,9 תהליך הדפסת דיו תרמית הוצגה זמני לשבש את קרום התא מבלי להשפיע על כדאיות התא. הנקבוביות חולפות בקרום ניתן להשתמש כדי להציג את מולקולות, אשר היה אחרת להיות גדול מכדי לעבור דרך הממברנה, לתוך הציטופלסמה של התא. 8,9,11
יישום שמפגינים כאן הוא השימוש הדפסת דיו תרמית על שילוב של מונומרים שכותרתו fluorescently G-אקטין לתוך התאים. היתרון בשימוש הדפסה הזרקת דיו תרמית להזריק מולקולות לתוך תאים היא הטכניקה היא סבירה יחסית לתאים. 8, 12 כדאיות התא לאחר ההדפסה הוכח להיות דומה לתא PLA תקןטינג שיטות 1,8. בנוסף, הדפסת דיו יכול לעבד אלפי תאים בתוך דקות, שזה הרבה יותר מהר מאשר microinjection ידנית. בנקבוביות נוצר על ידי הדפסה הוכחו להיסגר בתוך כשעתיים. עם זאת, אין הגבלה על גודל הנקבוביות של יצירה (~~~HEAD=NNS 10 ננומטר) עם טכניקה זו הדפסה, אשר מגביל את הטכניקה כדי הזרקת תאים עם חלבונים קטנים ו / או חלקיקים. 8,9,11
תקן HP Deskjet 500 Printer שונה, כדי לאפשר הדפסה התא. 3, 5, 8 הכיסוי של המדפסת הוסר מנגנון הזנת הנייר היה לעקוף באמצעות מנוף מכני. בשלב נוצר כדי לאפשר הצבת של שקופיות מיקרוסקופ ו coverslips ישירות תחת ראש ההדפסה. מחסניות דיו נפתחו, דיו הוסר והם נוקו לפני השימוש עם תאים. דפוס הדפסה נוצר באמצעות תוכנת ציור רגיל, אשר לאחר מכן נשלט על המדפסת באמצעות הפקודה הדפסה פשוטה. 3T3 fibroהפיצוצים היו גדולים כדי המפגש, trypsinized, ו resuspended מכן לתוך פוספט שנאגרו מלוחים עם מסיסים G-אקטין מונומרים שכותרתו fluorescently. ההשעיה התא pipetted לתוך מחסנית דיו שורות של תאים הודפסו על גבי זכוכית מיקרוסקופ תלושי כיסוי. התאים היו חיים צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו אקטין נמצא ברחבי הציטופלסמה. שילוב של אקטין פלואורסצנטי לתוך התא מאפשר הדמיה של זמן קצר הדינמיקה cytoskeletal והוא שימושי למגוון רחב של יישומים. 13-15
Protocol
Discussion
תהליך להמיר רגילות למדפסת הזרקת דיו עבור שולחן העבודה bioprinting לא קשה במיוחד. השלב המאתגר ביותר הוא לקבוע כיצד לעקוף את מנגנון הזנת הנייר, אשר תלויה המותג והדגם של המדפסת בשימוש. עם זאת, זה פשוט יחסית, כאשר חיישן הזנת הנייר הוא מכני, כמתואר כאן. עבור דגמים עם חיישנים אופטיים להאכיל, טכניקות אחרים עשויים צריך להיות מועסק על מנת להערים על מדפסת לחשוב זה היא באמצעות נייר, למשל, אפשר להפעיל פיסת נייר קטנה דרך המדפסת בזמן שהוא מדפיס בשקופית מיקרוסקופ. עקיפת מנגנון הזנת הנייר עשויה להיות הצעד הקשה ביותר ליישום נהלים אלה למודלים מדפסת אחר.
כאשר בניית השלב להחזיק את coverslips להדפסה, חשוב כדי להבטיח יישור גובה תקין. שלב צריך לאפשר coverslip כדי להיות ממוקם באמצע אזור ההדפסה. בנוסף, הוא צריך PLאייס coverslip בגובה מספיק כדי לאפשר פינוי של מחסנית ההדפסה לעבור על השקופיות מבלי לשבש אותה. הגובה המדויק של הבמה תלוי בדגם המדפסת.
על מנת להבטיח כי תאים מודפסים לא מקבלים שטף, השקופיות הונחו באינקובטור מיד לאחר ההדפסה למשך כ 30 דקות, כדי לאפשר התקשרות לתא לפני נוספות הצמיחה מדיה תא נוסף. כי התאים הודפסו הפתרון הכולל כמויות גדולות של PBS התאים לא התייבש ונותר בת קיימא. התאים היו צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לדמיין את חלוקת ה-G-אקטין מונומרים מתוייגים בתוך התא (איורים 1, 5-7). בעת הדפסה עם fibroblasts 3T3, איור 5 מראה תוצאה מייצג, עם אקטין גורם הרבה של התא כדי לזרוח, אבל לראווה שורות בהירות מוגברת. שילוב של מתויג fluorescently G-אקטין את cytoskeleton הואשימושי לחקר הדינמיקה cytoskeletal ומכניקה סלולריים. 12-15 הגבלה של הטכניקה הזו הוא שהיא חלה רק על מולקולות וחלבונים בעלי קוטר קטן יותר מאשר כ 10 ננומטר.
על מנת להבטיח כי התאים היו ממש בטיפול ידי המדפסת המרה, DAPI (1:5000 ב PBS) נוספה bioink במקום מחצית מהיקף טהור PBS. DAPI כתם ניאון נקשר מנות חומצות האמינו העשירות של ה-DNA הנמצאים בגרעין. לכן DAPI הוא כתם שימושי גרעינים fluorescently הדמיה של תאים מודפסים. איור 6 מציג תמונה מייצגת של תא מציג גם פלואוריד Alexa 488 (אקטין) ו DAPI (גרעין) פלואורסצנטי עם תמונה כיסוי של שניהם. איור 7 גם ממחיש עד כמה התאים יהיה לזרוח פעם את G-אקטין מונומרים שולבו בזמן הלא ביולוגית חומר הופקד לתוך המדגם לא לזרוח בגלל absencדואר של G-אקטין מונומרים.
שיקול אחד חשוב bioprinting היא התקשורת מימית בשימוש עבור bioink. נמצא כי באמצעות תקן התקשורת הצמיחה סלולריים עם סרום הניבו תוצאות לא עקביות. זהו ככל הנראה בשל סתימת של הדפסה חרירי ראש שנכתבו על ידי חלבונים בדם. השימוש PBS גדל עקביות של דפוסי המודפסים ומספר תאים שהופקדו. חסרון אחד לשימוש PBS היא לא התאים יש להשאיר את ההשעיה לתקופות זמן ממושכות. עם זאת, fibroblasts בדוגמאות הללו היו מסוגלים לסבול את התנאים bioink במשך שעה לפחות ללא שינוי כדאיות התא. זה עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים מספר, אשר מדווחים כי תאי מודפסים באמצעות מנגנוני הזרקת דיו תרמית הוכחו יש שיעור גבוה הכדאיות. 2-8
הגדרת מדפסת שונה יכול לשמש ליישומים אחרים מלבד הדפסה התא. 16-22 חלבונים מטריקס, כגון קולגן או fibronectin, ניתן להדפיס בקלות על גבי מצעים בעזרת טכניקה זו, אשר יכול להיות שימושי עבור דפוסים התא. עבור סוג, למשל קולגן הדפסתי את דפוסי קו תגרום מצעים קולגן מסודרים בהם ניתן להשתמש על התרבות תאים במבחנה. 17 בנוסף חלבונים מטריקס, מולקולות אחרות, כולל גורמי גדילה, יכול להיות מקומי אמין ללימודי תאים על מצעים וגם לפוטנציאל הריפוי. 18
המגבלה העיקרית של עיצוב תיאר את השלבים לעיל היא כי המדפסת הזו הוא לא מסוגל להדפיס בממד אחד או יותר. זה מגביל את הפוטנציאל לשימוש ביישומים בדוגמת כגון הדפסה הפיגום. כדי לאפשר הדפסה 3D, הבמה המקצועית צריך לשמש. שלב צריך להיות התאמות גובה מצטבר עבור בתצהיר שכבה אחר שכבה של bioink.
Bioprinting הוכיח הבטחה כשיטה יעילה וחסכונית עבור הנדסת רקמות,, Transfection micropatterning ו microarray ייצור הגן 1-12, 16-22 היישומים העתידיים של סוג זה של המכשיר הם רבים, כולל:. יצירת microenvironments הסלולר שבשליטת בדוגמת, שילוב של מקרומולקולות לתוך הציטופלסמה התא, וכן בתצהיר של תאים על פיגומים ומבנים שאינם באופן טבעי או ביעילות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר ד"ר תומס בולנד על הרעיון של שימוש המדפסות של HP DeskJet להדפסה התא. המימון לפרויקט זה מתוך 0903795 NSF RII-EPS ו NIH K25 HL0922280.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| HP DeskJet 500 | Hewlett-Packard | C2106A | Discontinued from manufacturer. Purchased refurbished DEC Trader. |
| HP 26 Black Ink Cartridge | Hewlett-Packard | 51626A | |
| Actin from rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate, 200 μg | Invitrogen | A12373 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | ICN1860454 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3002201 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco | VLF 797 | Optional housing for keeping printer aseptic |
References
- Calvert, P. Materials science. Printing cells. Science. 318, 208-209 (2007).
- Mironov, V., Reis, ., Derby, B. Review: Bioprinting: A beginning. Tissue Eng. 12, 631-634 (2006).
- Pepper, M. E., Parzel, C. A., Burg, T., Boland, T., Burg, K. J. L., Groff, R. E. Design and Implementation of a two-dimensional inkjet bioprinter. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 3-6, 6001-6005 (2009).
- Campbell, P., Weiss, L. Tissue engineering with the aid of inkjet printers. Expert Opin. Biol. Th. 7, 1123-1127 (2007).
- Boland, T., Xu, T., Damon, B., Cui, X. Application of inkjet printing to tissue engineering. Biotechnol. J. 1, 910-917 (2006).
- Mironov, V., Prestwich, G., Forgacs, G. Bioprinting Living Structures. J. Mater. Chem. 17, 2054-2060 (2007).
- Xu, T., Rohozinski, J., Zhao, W., Moorefield, E. C., Atala, A., Yoo, J. J. Inkjet-mediated gene transfection into living cells combined with targeted delivery. Tissue Eng. Part A. 15, 95-101 (2009).
- Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z., Boland, T. Cell Damage Evaluation of Thermal Inkjet Printed Chinese Hamster Ovary Cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Saunders, R., Derby, B. B. i. o. p. r. i. n. t. i. n. g. Inkjet Deposition. Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology. 15, (2010).
- Prabha, S., Zhou, W., Panyam, J., Labhasetwar, V. Size-dependency of nanoparticle mediated gene transfection: studies with fractioned nanoparticles. Int. J. Pharm. 244, 105-115 (2002).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
- Apodaca, G. Endocytic Traffic in Polarized Epithelial Cells: Role of Actin and microtubule Cytoskeleton. Traffic. 2, 149-159 (2001).
- Hotulainen, P., Llano, O., Smirnov, S., Tanhuanpää, K., Faix, G., Rivera, C., Lappalainen, P. Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis. J. Cell Biol. 185, 323-339 (2009).
- Allen, P. G. Actin filament uncapping localizes to ruffling lamellaw and rocketing vesicles. Nat Cell Biol. 5, 972-979 (2003).
- Cooper, G. M., Miller, E. D., Desesare, G. E., Usas, A., Lensie, E. L., Bykowski, M. R., Huard, J., Weiss, L. E., Losee, J. E., Campbell, P. G. Inkjet-based biopatterning of bone morphogenetic protein-2 to spatially control calvarial bone formation. Tissue Eng. Part A. 16, 1749-1759 (2010).
- Deitch, S., Kunkle, C., Cui, X., Boland, T., Dean, D. Collagen matrix alignment using inkjet printer technology. Proc. 1094 (DD. , 7-16 (2008).
- Ilkhanizadeh, S., Teixeira, A., Hermanson, O. Inkjet printing of macromolecules on hydrogels to steer neural stem cell differentiation. Biomaterials. 28, 3936-3943 (2007).
- Ringeisen, B. R., Orthon, C. M., Barron, J. A., Young, D., Sparago, B. J. Jet-based methods to print living cells. Biotechnol. J. 1, 930-948 (2006).
- Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260, 920-926 (1993).
- Okamoto, T., Suzuki, T., Yamamoto, N. Microarray fabrication with covalent attatchment of DNA using Bubble Jet technology. Nature Biotechnol. 18, 438-441 (2000).
