El diagnóstico de tuberculosis pulmonar con el Xpert MTB / RIF prueba

Estándar 2 de las Normas Internacionales para la Tuberculosis estados cuidado de que todos los pacientes con sospecha de tuberculosis pulmonar debe presentar al menos dos muestras de esputo para examen bacteriológico. Cuando sea posible, al menos una mañana temprano muestra debe ser obtenida, como esputo recogido en este momento tiene el mayor rendimiento. 11 El Xpert MTB / RIF ensayo puede ser aplicado a las muestras de esputo o sedimentos concentrados preparados a partir de esputo expectorado inducido o esputos que son . ya sea bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) con baciloscopía positiva o negativa 6, 12, 13 El ensayo está diseñado para utilizarse con muestras de pacientes para los cuales hay sospecha clínica de tuberculosis pulmonar que tienen: 1) no ha recibido tratamiento antituberculoso, 2 ) tenían menos de 7 días de terapia, o 3) no han recibido tratamiento en los últimos 60 días. Ten en cuenta que no debe ser usado para monitorear los efectos de la terapia con medicamentos 7, porque el ADN bacteriano puede persistir después de la terapia antimicrobiana. <pclass = "jove_content"> Tratar de muestras clínicas, incluyendo los cartuchos usados, como si fueran capaces de transmitir agentes infecciosos. Utilice las precauciones adecuadas, tales como el uso de guantes de protección desechables, batas de laboratorio y protección para los ojos, y seguir los procedimientos de su institución y directrices de seguridad. 1. Las muestras de esputo expectorado Nota: El proceso sólo muchos ejemplares de una sola vez, ya que hay GeneXpert sistema DX módulos disponibles para ejecutar la prueba! Marca cada uno de Xpert MTB / RIF cartucho con el ID de la muestra correspondiente. Transferir 1,0 ml de esputo expectorado a una cónica, con tapón de rosca del tubo con una pipeta de transferencia estéril. Alternativamente, la muestra completa se puede procesar en el original a prueba de fugas contenedor de recogida de esputos. Añadir 2,0 ml Xpert MTB / RIF reactivo Muestra (2:1, v / v) para el esputo expectorado utilizando una pipeta de transferencia estéril. Vuelva a colocar la tapa y agitar el tubo vigorosamente 10-20 Veces. Alternativamente, la mezcla puede ser vortex (30 segundos). Permitir el tubo en posición vertical durante 5 min a temperatura ambiente. Agite el tubo vigorosamente 10-20 veces. También puede utilizar un vórtice (30 seg). Permitir el tubo en posición vertical durante otros 10 minutos a temperatura ambiente. Inspeccione las muestras: las muestras deben ser licuado y sin grumos visibles de esputo. 2. Los sedimentos concentrados Nota: El proceso sólo muchos ejemplares de una sola vez, ya que hay GeneXpert sistema DX módulos disponibles para ejecutar las pruebas! Marca cada uno de Xpert MTB / RIF cartucho con el ID de la muestra correspondiente. Transferir 1,5 ml Xpert MTB / RIF reactivo a una muestra cónica, con tapón de rosca del tubo con una pipeta de transferencia estéril. Añadir al menos 0,5 ml de sedimento concentrado al tubo de reactivo que contiene la muestra usando una pipeta de transferencia estéril. Vuelva a colocar la tapa y agitar el tubo de vigorously 10-20 veces. También puede utilizar un vórtice (30 seg). Permitir el tubo en posición vertical durante 5 min a temperatura ambiente. Agite el tubo vigorosamente 10-20 veces. También puede utilizar un vórtice (30 seg). Permitir el tubo en posición vertical durante otros 10 minutos a temperatura ambiente. Inspeccione las muestras: las muestras deben ser licuado y sin grumos visibles de esputo. 3. Carga del Xpert MTB / RIF Cartucho Nota: Comience la prueba en 30 minutos de la adición de la muestra en el cartucho! Revise las etiquetas de la MTB Xpert / cartucho de RIF y el ID de la muestra. Abra la tapa del cartucho. Utilizando la pipeta de transferencia estéril suministrado, aspirar la muestra licuado en la pipeta de transferencia hasta que el menisco está por encima de la marca mínima y transferir la muestra en el puerto abierto del Xpert MTB / RIF cartucho. Nota:Dispense lentamente para minimizar el riesgo de formación de aerosol! Cierre la tapa del cartucho. 4. Inicio de la prueba Nota: Antes de comenzar la prueba, asegúrese de que el Sistema de GeneXpert Dx está equipado con el software GX2.1, y el Xpert MTB / RIF ensayo se importan en el software de 9! Encienda el ordenador y, a continuación, encienda el instrumento GeneXpert Dx. En el escritorio de Windows, haga doble clic en el icono de acceso directo GeneXpert Dx. Inicie sesión en el software del sistema GeneXpert Dx con su nombre de usuario y contraseña. En la ventana Sistema GeneXpert Dx, haga clic en Crear prueba. El cartucho de escaneo de código de barras el cuadro de diálogo. En el cuadro de ID de la muestra, lea o escriba el ID de la muestra. Explorar el código de barras en el Xpert MTB / RIF cartucho. La ventana de prueba que aparezca Crear. Haga clic en Inicio de prueba </strong>, e introduzca su contraseña en el cuadro de diálogo que aparece. Abra la puerta del módulo de instrumento con la luz verde parpadea, y cargar el cartucho. Cierre la puerta. La prueba se inicia y la luz deja de parpadear y se mantiene constantemente en verde. Cuando la prueba haya finalizado, la luz se apaga. Espere hasta que el sistema libera la cerradura de la puerta al final de la carrera, a continuación, abra la puerta del módulo y retire el cartucho. Deseche los cartuchos utilizados en los contenedores de desechos apropiados de acuerdo a las prácticas habituales de la institución. 5. Los resultados representativos Cada Xpert MTB / RIF cartucho incluye reactivos para la detección de MTB complejo y resistencia a RIF, así como un control de procesamiento de la muestra (CPE) para controlar el procesamiento adecuado de las bacterias diana y para controlar la presencia de inhibidor de la (s) en la reacción de PCR . El control de comprobación de sonda (PCC) verifica la rehidratación reactivo, tubo de PCR rellenandoel cartucho, la estabilidad integridad de la sonda, y el tinte. 9 Los cebadores en el Xpert MTB / RIF ensayo amplificar una porción del gen rpoB que contiene el par 81 de base "núcleo" región. Cinco de diferente color fluorogénicos sondas de hibridación de ácidos nucleicos, llamados balizas moleculares, interrogar toda la 81-pb núcleo. 14 Cada baliza molecular fue diseñado para ser tan específica que no se une a su destino si la secuencia diana difiere de la de tipo salvaje rpoB secuencia por tan poco como una sustitución de un solo nucleótido. Desde fluorescencia molecular balizas sólo cuando están unidos a sus objetivos, es decir, de tipo salvaje secuencia rpoB, la ausencia de cualquiera de los cinco colores en el ensayo de diferenciar entre la conservadas secuencia del tipo salvaje y las mutaciones en la región del núcleo que están asociados con resistencia a RIF. 6 La RCP debe ser positivo en una muestra negativa y puede ser negativo o positivo en una muestra positiva. La pruebaresultado será "no válida" si el CPE no se detecta en una prueba negativa. Antes del inicio de la reacción de PCR, el Sistema GeneXpert Dx mide la señal de fluorescencia de las sondas para controlar la rehidratación talón, el llenado de reacción de tubo, la integridad de la sonda y la estabilidad del colorante. El PCC pasa si la señal de fluorescencia de las sondas cumple con los criterios de aceptación asignadas. Los resultados son interpretados por el sistema de GeneXpert Dx de las señales de fluorescencia medidos y algoritmos de cálculo integradas y se muestran en la ventana de resultados 9, como se indica a continuación: MTB Detectado: ADN diana se detecta MTB; ambos controles, SPC y el PCC, cumplir con los criterios de aceptación asignadas. Los valores más bajos de Ct representan una mayor concentración de partida de molde de DNA; valores más altos de Ct representan una menor concentración de molde de ADN. En los resultados de MTB detectados "resistencia a RIF DETECTED" (Figura 1A), "NO DETECTA resistencia a RIF" ( <str1B ong> Figura), o "resistencia a RIF INDETERMINADO" se mostrará en una línea separada. BTT no se detecta: el ADN de MTB de destino no se detecta, tanto en los controles, SPC y el PCC, cumplir con los criterios de aceptación asignadas (Figura 2). Inválido: La presencia o ausencia de MTB no se puede determinar: SPC no cumple con los criterios de aceptación, es decir, la muestra no ha sido procesada correctamente, o PCR fue inhibida (Figura 3). Nota: repetición de la prueba con la muestra extra! Error: Uno o más de los resultados fallidos del PCC (FAIL). Tanto BTT y SPC muestra ningún resultado. Nota: repetición de la prueba con la muestra extra! Si el PCC pasado (PASS), el error está causado por un fallo de un componente del sistema. Figura 1: ADN MTB blanco es detectado, tanto en los controles, SPC y el PCC, cumplir con los criterios de aceptación asignadas. Los valores más bajos de Ct representa una partida más altaconcentración de ADN molde; valores más altos de Ct representan una menor concentración de molde de ADN. En los resultados de MTB detectado "no resistencia a RIF DETECTED" (Figura 1A), "resistencia a RIF DETECTED" (fig. 1B), o "resistencia a RIF INDETERMINADO" se mostrará en una línea separada. . Figura 1A MTB DETECTADO; resistencia a RIF NO DETECTA, es decir, sólo la de tipo salvaje secuencia de ácido nucleico de la RIF de 81 pb resistencia a la determinación de la región (RRDR) del gen rpoB estaba presente 6. Haga clic aquí para ver más grande la figura . . Figura 1B MTB DETECTADO; resistencia a RIF DETECTADO. Completa abandonar la Probe B (flecha), que cubre las posiciones 513 a 517 de la R RDR del gen rpoB. 6 En el ejemplo, la secuenciación parcial reveló que la mutación del gen rpoB D516V se detectó. 8 Haga clic aquí para ver más grande la figura . Figura 2 ADN MTB objetivo no se ha detectado,.. Ambos controles, SPC y el PCC, cumplir con los criterios de aceptación asignados Haga clic aquí para ver más grande la figura . . Resultado la Figura 3 la prueba no válida, es decir, presencia o ausencia de MTB no se puede determinar: SPC no cumple con los criterios de aceptación, ya que la muestra no ha sido procesada correctamente, o porque se inhibe la PCR.3547fig3large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande figura.