Diagnosticare la tubercolosi polmonare con la MTB / RIF test Xpert

Standard 2 delle norme internazionali per la tubercolosi afferma che cura tutti i pazienti con sospetto di TBC polmonare dovrebbe presentare almeno due campioni di espettorato per l'esame batteriologico. Quando è possibile, almeno una al mattino presto campione deve essere ottenuto, come espettorato raccolto in questo momento ha il più alto rendimento. Il 11 Xpert MTB / RIF dosaggio può essere applicato a campioni di espettorato o sedimenti espettorato concentrati ottenuti da espettorato indotto o sputi che sono . o bacilli acido-resistenti (AFB) striscio positivo o negativo 6, 12, 13 Il test è stato progettato per l'uso con campioni provenienti da pazienti per i quali vi è il sospetto clinico di tubercolosi polmonare che hanno: 1) non hanno ricevuto terapia anti-tubercolosi, 2 ) aveva meno di 7 giorni di terapia, o 3) non hanno ricevuto la terapia negli ultimi 60 giorni. Do atto che non dovrebbe essere utilizzato per monitorare gli effetti della terapia farmacologica 7 perché il DNA batterico potrebbe persistere anche dopo terapia antibiotica. <pclass = "jove_content"> Treat campioni clinici, comprese le cartucce usate, come se in grado di trasmettere agenti infettivi. Usare le dovute precauzioni, come ad esempio indossando guanti monouso, camici da laboratorio e occhiali di protezione, e seguire le procedure di sicurezza del vostro istituto e linee guida. 1. Esempi di espettorato Nota: Il processo solo come molti esemplari in una sola volta, in quanto vi sono GeneXpert sistema DX moduli a disposizione per eseguire il test! Etichettare ogni MTB / RIF Xpert cartuccia con l'ID del campione corrispondente. Transfer 1,0 ml espettorato sputum una conica, con tappo a vite tubo con una pipetta sterile trasferimento. In alternativa, l'intero campione può essere trattato in originale tenuta stagna espettorato contenitore di raccolta. Aggiungere 2,0 ml Xpert MTB / RIF Reagente Sample (2:1, v / v) al espettorato usando una pipetta sterile trasferimento. Sostituire il coperchio, e agitare il tubo energicamente 10-20 Volte. In alternativa, la miscela può essere agitati (30 sec). Lasciare il tubo in posizione verticale per 5 min a temperatura ambiente. Agitare vigorosamente il tubo di 10-20 volte. In alternativa, utilizzare un vortice (30 sec). Lasciare il tubo in posizione verticale per altri 10 minuti a temperatura ambiente. Controllare i campioni: i campioni devono essere liquefatto senza grumi visibili di espettorato. 2. Sedimenti concentrati Nota: Il processo solo come molti esemplari in una sola volta come ci sono GeneXpert sistema DX moduli disponibili per eseguire i test! Etichettare ogni MTB / RIF Xpert cartuccia con l'ID del campione corrispondente. Trasferire 1,5 ml Xpert MTB / RIF Reagente di esempio per uno conico, con tappo a vite tubo con una pipetta sterile trasferimento. Aggiungere almeno 0,5 ml sedimento concentrato al tubo reagente Campione contenente usando una pipetta sterile trasferimento. Sostituire il coperchio e agitare il tubo vigorously 10-20 volte. In alternativa, utilizzare un vortice (30 sec). Lasciare il tubo in posizione verticale per 5 min a temperatura ambiente. Agitare vigorosamente il tubo di 10-20 volte. In alternativa, utilizzare un vortice (30 sec). Lasciare il tubo in posizione verticale per altri 10 minuti a temperatura ambiente. Controllare i campioni: i campioni devono essere liquefatto senza grumi visibili di espettorato. 3. Caricamento della MTB / RIF Xpert Cartuccia Nota: Iniziare il test entro 30 minuti dall'aggiunta del campione alla cartuccia! Controllare le etichette sul Xpert MTB / RIF cartuccia e l'ID campione. Aprire il coperchio della cartuccia. Utilizzando la pipetta sterile trasferimento previsto, aspirare il campione liquefatto nella pipetta di trasferimento del menisco fino a superare il minimo e trasferire il campione nella porta aperta del MTB / RIF Xpert cartuccia. Note:Versare lentamente per minimizzare il rischio di formazione di aerosol! Chiudere il coperchio della cartuccia. 4. Avvio del test Nota: Prima di iniziare il test, assicurarsi che il sistema GeneXpert Dx è equipaggiato con il software GX2.1, e la MTB / RIF Xpert test viene importato nel software 9! Accendere il computer, e poi accendere lo strumento GeneXpert Dx. Sul desktop di Windows, fare doppio clic sul collegamento GeneXpert Dx icona. Accedere al software GeneXpert sistema DX utilizzando il nome utente e la password. Nella finestra GeneXpert sistema DX, fare clic su Crea test. La confezione della cartuccia di scansione di codici a barre di dialogo. Nella casella ID campione, eseguire la scansione o digitare l'ID campione. Eseguire la scansione del codice a barre sulla MTB / RIF Xpert cartuccia. La finestra Test Crea appare. Fare clic su Start test </strong>, e inserire la password nella finestra di dialogo che appare. Aprire lo sportello del modulo strumento con la luce verde lampeggiante, e caricare la cartuccia. Chiudere lo sportello. La prova inizia e la luce smette di lampeggiare e rimane sempre verde. Quando il test è finito, la luce si spegne. Attendere il sistema rilascia il blocco porta alla fine della corsa, quindi aprire lo sportello e rimuovere la cartuccia. Smaltire cartucce usate nelle opportuni contenitori dei rifiuti secondo le procedure standard del vostro istituto. 5. Risultati rappresentativi Ogni MTB / RIF Xpert cartuccia include reagenti per la rilevazione di MTB complessa e resistenza RIF nonché un controllo di elaborazione di campione (SPC) per controllare per l'elaborazione adeguata dei batteri bersaglio e per monitorare la presenza di inibitore (s) nella reazione PCR . Il Check Control Probe (PCC) verifica reidratazione reagente, tubo PCR compilandola cartuccia, stabilità integrità sonda, e colorante. 9 Gli inneschi della MTB / RIF dosaggio Xpert amplificare una porzione del gene rpoB contenente il 81 paia di basi regione "core". Cinque colore diverso fluorogenici sonde di ibridazione di acidi nucleici, detti segnali molecolari, interrogare l'intero nucleo 81-bp. 14 Ogni segnale molecolare è stato progettato per essere in modo specifico che non si lega al suo bersaglio se la sequenza bersaglio differisce dal tipo selvatico rpoB sequenza da un minimo di una singola sostituzione nucleotidica. Poiché molecolare fluorescenza fari solo quando essi sono legati per i loro obiettivi, cioè sequenza wild-type rpoB, l'assenza di uno dei cinque colori nel saggio differenziare tra la conservata sequenza wild-type e mutazioni nella regione di core che sono associati RIF resistenza 6. Il SPC dovrebbe essere positiva in un campione negativo e può essere positivo o negativo in un campione positivo. Il testrisultato sarà "valido" se il SPC non viene rilevato in un test negativo. Prima dell'inizio della reazione PCR, il sistema GeneXpert Dx misura il segnale di fluorescenza delle sonde per monitorare reidratazione tallone, reazione tubo di riempimento, l'integrità e la stabilità dei coloranti sonda. Il PCC passa se il segnale di fluorescenza dalle sonde soddisfa i criteri di accettazione assegnati. I risultati vengono interpretati dal sistema GeneXpert Dx dal misurati segnali di fluorescenza e gli algoritmi di calcolo embedded e vengono visualizzati nella finestra View Results 9, come di seguito indicato: Riconosciuto MTB: MTB DNA bersaglio viene rilevato, entrambi i controlli, SPC e PCC, soddisfano i criteri di accettazione assegnati. Valori inferiori Ct rappresentano una maggiore concentrazione iniziale dello stampo di DNA; elevati valori di Ct rappresentano una concentrazione inferiore di stampo di DNA. Nei risultati MTB rilevati "Resistance RIF DETECTED" (Figura 1A), "NON RILEVATA RIF Resistance" ( <strong> Figura 1B), o "resistenza RIF INDETERMINATO" verrà visualizzato su una riga separata. MTB Non rilevato: DNA bersaglio MTB non viene rilevata, entrambi i controlli, SPC e PCC, soddisfano i criteri di accettazione assegnati (Figura 2). Non valido: presenza o assenza di MTB non può essere determinato: SPC non soddisfa i criteri di accettazione, ossia il campione non è stata adeguatamente elaborata, o PCR è stata inibita (Figura 3). Nota: ripetere il test con il campione in più! Errore: Uno o più dei risultati PCC falliti (FAIL). Sia MTB e SPC visualizzare alcun risultato. Nota: ripetere il test con il campione in più! Se il PCC passato (PASS), l'errore è causato da un guasto di un componente del sistema. Figura 1: DNA bersaglio MTB viene rilevato, entrambi i controlli, SPC e PCC, soddisfano i criteri di accettazione assegnati. Valori più bassi Ct rappresentano una partenza più altoconcentrazione di DNA templato; elevati valori di Ct rappresentano una concentrazione inferiore di stampo di DNA. Nei risultati MTB RILEVATI "NON RILEVATO RIF Resistance" (Figura 1A), "Resistenza RIF DETECTED" (Figura 1B), o "resistenza RIF INDETERMINATO" verrà visualizzato su una riga separata. . Figura 1A MTB rilevato; Resistenza RIF NON RILEVATO, cioè solo il wild-type sequenza di acido nucleico del 81-bp RIF resistenza determinazione regione (RRDR) del gene era presente rpoB 6. Clicca qui per ingrandire la figura . . Figura 1B MTB rilevato; Resistenza RILEVATO RIF. Completa abbandonare la Probe B (freccia), che copre le posizioni 513-517 della R RDR del gene rpoB. 6 Nella esempio, la sequenza parziale ha rivelato che il gene rpoB mutazione D516V è stato rilevato. 8 Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 2 DNA bersaglio MTB non è stata rilevata;.. Entrambi i controlli, SPC e PCC, soddisfano i criteri di accettazione assegnati Clicca qui per ingrandire la figura . . Risultato del test Figura 3 valide, ossia presenza o assenza di MTB non può essere determinato: SPC non soddisfa i criteri di accettazione, perché il campione non è stata adeguatamente elaborata, o perché PCR è stato inibito.3547fig3large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.