Диагностика туберкулеза легких с Xpert MTB / RIF испытаний

Стандартный 2 Международные стандарты медицинской помощи больным туберкулезом утверждает, что все пациентов с подозрением на туберкулез легких должны представить не менее двух образцов мокроты для бактериологического исследования. Когда это возможно, по крайней мере одного утреннего образца должны быть получены, как мокроты, собранных на данный момент имеет самый высокий урожай. 11 Xpert MTB / RIF анализ может быть применен к мокроте или концентрированного осадка мокроты готовили из индуцированных или отхаркиваемой мокроты, которые . либо кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) мазок положительный или отрицательный 6, 12, 13 тест предназначен для использования с образцами от пациентов, у которых есть клиническое подозрение на туберкулез легких, которые имеют: 1) не получили противотуберкулезные терапии, 2 ) было <7 дней терапии, или 3) не получили лечение в течение последних 60 дней. Обратите внимание, что она не должна быть использована для мониторинга воздействия лекарственной терапии 7, так как бактериальная ДНК может сохраняться после антибактериальной терапии. <pкласс = "jove_content"> Лечение клинических образцов, в том числе использованные картриджи, как если бы способны передавать инфекционные агенты. Использование надлежащих мер предосторожности, таких как ношение защитной одноразовые перчатки, лабораторный халат и защитные очки, и следуй за безопасность вашей организации процедур и руководящих принципов. 1. Отхаркивается Образцы мокроты Примечание: Процесс ровно столько образцов в одно время, так как есть GeneXpert системы Dx модули, доступные для выполнения теста! На каждом Xpert MTB / RIF картридж с соответствующим идентификатором экземпляра. Передача 1,0 мл мокроты отхаркивается к конической, с завинчивающимися крышками трубки с помощью стерильной пипетки передачи. Кроме того, весь образец могут быть обработаны в оригинальной герметичной контейнер забора мокроты. Добавить 2,0 мл Xpert MTB / RIF образец реагента (2:1, об / об) в отхаркиваемой мокроты помощью стерильной пипетки передачи. Замените крышку и встряхнуть трубку энергично 10-20 Раз. Кроме того, смесь может быть встряхивали (30 сек). Позвольте трубку стоять в течение 5 мин при комнатной температуре. Встряхните трубка энергично 10-20 раз. Кроме того, использование вихря (30 сек). Позвольте трубку стоять еще 10 мин при комнатной температуре. Проверка образцов: Образцы должны быть сжиженный без видимых сгустков мокроты. 2. Концентрированный осадков Примечание: Процесс ровно столько образцов в одно время, как есть GeneXpert системы Dx модули, доступные для запуска тестов! На каждом Xpert MTB / RIF картридж с соответствующим идентификатором экземпляра. Передача 1,5 мл Xpert MTB / RIF образец реагента конические, завинчивающимися крышками трубки с помощью стерильной пипетки передачи. Добавить по крайней мере, 0,5 мл концентрированного осадка для образца содержащего реагента трубки с помощью стерильной пипетки передачи. Замените крышку и встряхнуть трубку Vigorously 10-20 раз. Кроме того, использование вихря (30 сек). Позвольте трубку стоять в течение 5 мин при комнатной температуре. Встряхните трубка энергично 10-20 раз. Кроме того, использование вихря (30 сек). Позвольте трубку стоять еще 10 мин при комнатной температуре. Проверка образцов: Образцы должны быть сжиженный без видимых сгустков мокроты. 3. Загрузка Xpert MTB / RIF картридж Обратите внимание: Начало тестов в течение 30 минут после пробы в картридже! Проверьте этикетки на Xpert MTB / RIF-картридж и образца ID. Откройте крышку картриджа. С помощью стерильной пипетки передачи при условии, аспирации сжиженного образец в передачи пипетки, пока мениск выше минимальной отметки и передачи образцов в открытый порт Xpert MTB / RIF картриджа. Примечание:Внесите медленно, чтобы минимизировать риск образования аэрозоля! Закройте крышку картриджа. 4. Начало испытаний Примечание: Перед началом теста, убедитесь, что система GeneXpert Dx оснащен GX2.1 программного обеспечения, и Xpert MTB / RIF анализа импортируется в программу 9! Включите компьютер, а затем включить прибор GeneXpert Dx. На рабочем столе дважды щелкните ярлык GeneXpert Dx значок. Вход в систему GeneXpert Dx программного обеспечения с использованием имени пользователя и пароля. В системе окно GeneXpert Dx, нажмите кнопку Создать тест. Штрих-код сканирования картриджа появляется диалоговое окно. В поле ID примера, сканирование или введите образец ID. Сканирование штрих-кодов на Xpert MTB / RIF картриджа. В окне Создать тест. Нажмите кнопку Пуск испытаний </сильный> и введите пароль в появившемся диалоговом окне. Откройте дверь, приборного отсека с мигающий зеленый свет, и загрузить картридж. Закройте дверь. Тест начинается и перестанет мигать и остается постоянно зеленый. Когда тест закончен, свет выключается. Подождите, пока система не освобождает замок в конце хода, откройте двери и модуль удаления картриджа. Утилизация использованных картриджей в соответствующие контейнеры для отходов в соответствии со стандартной практикой вашей организации. 5. Представитель Результаты Каждый Xpert MTB / RIF картриджа включает в себя реагенты для обнаружения сложных и MTB РИФ сопротивление, а также контроль обработки образцов (SPC) для контроля за адекватную обработку целевой бактерий и контролировать присутствие ингибитора (ы) в реакции ПЦР . Управление Probe Check (PCC) проверяет реагент регидратации, ПЦР трубки заполнениякартридж, датчик целостности и стабильности красителя. 9 праймеров в Xpert MTB / RIF анализа усилить часть гроВ ген содержащей 81 пар оснований, "ядро" региона. Пять разноцветных флуорогенных нуклеиновой кислоты зондов гибридизации, называются молекулярными маяками, допросить всего 81 б.п. ядра. 14 Каждая молекулярная маяк был разработан, чтобы быть настолько специфичны, что он не привязан к своей цели, если цель отличается от последовательности дикого типа гроВ последовательности всего один нуклеотид замены. С молекулярной флуоресценции маяки только тогда, когда они привязаны к своей цели, то есть дикий тип гроВ последовательность, отсутствие одного из пяти цветов в анализ различий между сохраняющейся дикого типа и мутации в ключевом регионе, которые связаны с РИФ сопротивление 6. СПК должны быть положительными в отрицательной пробы и может быть положительным или отрицательным в положительном образце. ТестРезультатом будет "Неверная", если НПФ не обнаружен в отрицательном. Перед началом реакции ПЦР, система GeneXpert Dx измеряет сигнал флуоресценции от датчиков контролировать шарик регидратации, реакция трубки наполнения, датчик целостности и стабильности красителя. PCC проходит, если флуоресцентного сигнала от датчиков соответствует заданным критериям признания. Полученные результаты интерпретируются в системе GeneXpert Dx от измеряемых сигналов флуоресценции и встроенные алгоритмы расчета и отображаются в окне просмотра результатов 9, как указано ниже: MTB Обнаружено: MTB ДНК цель обнаружена, как управление, SPC и PCC, отвечают заданным критериям признания. Нижняя Ct значения представляют собой более высокий исходной концентрации ДНК-матрицы, выше Ct значения представляют собой более низкую концентрацию ДНК. В MTB ОБНАРУЖЕН результаты "РИФ сопротивления ОБНАРУЖЕН" (рис. 1А), "РИФ сопротивления не обнаружен" ( <strОнг> Рисунок 1B), или "РИФ сопротивление неопределенный" будет отображаться на отдельной линии. МТБ не обнаружена: MTB целевой ДНК не обнаружено, оба управления, SPC и PCC, отвечают назначены критерии приемки (рис. 2). Неверная: Наличие или отсутствие MTB не может быть определена: SPC не соответствуют критериям приемлемости, то есть образец не был должным образом обработан, или ПЦР подавляется (рис. 3). Примечание: повторный тест с дополнительным образца! Ошибка: один или несколько результатов удалось PCC (FAIL). И MTB и SPC отображения результата нет. Примечание: повторный тест с дополнительным образца! Если прошло PCC (PASS), ошибка вызвана отказом компонентов системы. Рисунок 1: MTB целевой ДНК обнаруживается, как управление, SPC и PCC, отвечают заданным критериям признания. Нижняя Ct значения представляют собой более высокий исходныйКонцентрация ДНК-матрицы, более высокие значения Ct представляет собой низкую концентрацию ДНК. В MTB ОБНАРУЖЕН результаты "РИФ сопротивления не обнаружен" (рис. 1А), «РИФ сопротивления ОБНАРУЖЕН" (рис. 1в), или "РИФ сопротивление неопределенный" будет отображаться на отдельной линии. На рис. 1А MTB обнаружены; РИФ сопротивления не обнаружено, то есть только дикий тип нуклеиновой кислоты из 81-ВР РИФ сопротивления определения региона (RRDR) гена гроВ присутствовало 6. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . На рис. 1B MTB обнаружены; РИФ сопротивления обнаружено. Заполните бросают Probe B (стрелка), которая охватывает позиции 513 до 517 R RDR гена гроВ. 6 В, например, частичное секвенирование показало, что ген мутации гроВ D516V было обнаружено 8. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 2 MTB целевой ДНК не была обнаружена,.. И управления, SPC и PCC, отвечают заданным критериям принятия Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 3. Неверный результат теста, то есть наличие или отсутствие MTB не может быть определена: SPC не соответствуют критериям приемлемости, поскольку выборка не была должным образом обработана, или потому, что ПЦР было законсервировано.3547fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить цифру.