Diagnose van longtuberculose met de Xpert MTB / RIF Test

Standaard 2 van de internationale normen voor tuberculose Care stelt dat alle patiënten met verdenking van het hebben van pulmonale tuberculose moeten ten minste twee sputum monsters voor bacteriologisch onderzoek in te dienen. Indien mogelijk, moet ten minste een 's morgens vroeg exemplaar worden verkregen, zoals sputum verzameld op dit moment heeft de hoogste opbrengst. 11 De Xpert MTB / RIF-test kan worden toegepast op sputum monsters of geconcentreerde sputum sedimenten bereid uit geïnduceerde of expectorated sputa die . ofwel zuurvaste bacillen (AFB) uitstrijkje positief of negatief 6, 12, 13 De test is bedoeld voor gebruik met specimens van patiënten voor wie er klinische verdenking van pulmonale TB die: 1) niet ontvangen anti-tuberculose therapie, 2 ) had <7 dagen van de therapie, of 3) niet ontvangen therapie in de laatste 60 dagen. Vergeet niet dat het niet mag worden gebruikt voor het bewaken van de effecten van de therapie 7 omdat bacterieel DNA zou kunnen blijven bestaan ​​na antimicrobiële therapie. <pclass = "jove_content"> Behandel klinische monsters, met inbegrip van gebruikte cartridges, alsof die in staat van overdracht van infectieuze agentia. Gebruik de juiste voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van beschermende wegwerphandschoenen, laboratorium-jassen en oogbescherming, en volg uw instelling de veiligheid van procedures en richtlijnen. 1. Opgehoest sputum monsters Let op: Proces slechts zoveel exemplaren in een keer, want er zijn GeneXpert DX-systeem modules beschikbaar voor de test uit te voeren! Label elke Xpert MTB / RIF cartridge met de bijbehorende monster ID. Breng 1,0 ml opgehoest sputum tot een conische, buisje met schroefdeksel behulp van een steriele transferpipet. Als alternatief kan het gehele monster worden verwerkt in de oorspronkelijke lekvrije sputum verzamelhouder. Voeg 2,0 ml Xpert MTB / RIF Sample Reagens (2:1, v / v) aan de opgehoest sputum met behulp van een steriele transferpipet. Plaats het deksel en schud de buis krachtig 10-20 Tijden. Ook kan het mengsel worden gewerveld (30 sec). Laat de buis rechtop staan ​​gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Schud de buis krachtig 10-20 keer. U kunt ook een vortex (30 sec). Laat de buis rechtop staan ​​nog 10 min bij kamertemperatuur. Inspecteer de monsters: monsters dienen te worden vloeibaar gemaakt zonder zichtbare bosjes van het sputum. 2. Geconcentreerde Sedimenten Let op: Proces slechts zoveel exemplaren in een keer want er zijn GeneXpert DX-systeem modules ter beschikking van de tests uit te voeren! Label elke Xpert MTB / RIF cartridge met de bijbehorende monster ID. Breng 1,5 ml Xpert MTB / RIF Sample reagens tot een conische, buisje met schroefdeksel behulp van een steriele transferpipet. Voeg ten minste 0,5 ml geconcentreerde sediment naar de Sample Reagens met buis met behulp van een steriele transferpipet. Plaats het deksel, en schud de buis vigorously 10-20 maal. U kunt ook een vortex (30 sec). Laat de buis rechtop staan ​​gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Schud de buis krachtig 10-20 keer. U kunt ook een vortex (30 sec). Laat de buis rechtop staan ​​nog 10 min bij kamertemperatuur. Inspecteer de monsters: monsters dienen te worden vloeibaar gemaakt zonder zichtbare bosjes van het sputum. 3. Het laden van de Xpert MTB / RIF Cartridge Let op: Start de test binnen 30 minuten na toevoeging van het monster aan de patroon! Controleer de etiketten op de Xpert MTB / RIF cartridge en het monster-ID. Open het cartridge deksel. Met behulp van het bijgeleverde transferpipet, aspireer het vloeibaar monster in de transferpipet totdat de meniscus is boven het minimum merk en overdracht van het monster in de open poort van de Xpert MTB / RIF cartridge. Opmerking:Breng langzaam het risico van aërosolvorming minimaliseren! Sluit de patroonhouder deksel. 4. Het starten van de test Opmerking: Voordat de test begint, ervoor zorgen dat de GeneXpert DX-systeem is uitgerust met de GX2.1 software, en de Xpert MTB / RIF-test wordt geïmporteerd in de software 9! Zet de computer aan en schakel de GeneXpert Dx instrument. Op het Windows-bureaublad, dubbelklikt u op het GeneXpert Dx snelkoppeling. Meld u aan bij de GeneXpert DX-systeem software met behulp van uw gebruikersnaam en wachtwoord. In de GeneXpert DX-systeem venster, klikt u op Test. De Scan Cartridge Barcode dialoogvenster verschijnt. In de Sample ID box, scannen of typ het monster ID. Scan de barcode op de Xpert MTB / RIF cartridge. Het aanmaken Test-venster verschijnt. Klik op Start Test </strong> en voer uw wachtwoord in het dialoogvenster dat verschijnt. Open het instrument module deur met het knipperen van het groene licht, en laad de cartridge. Sluit de deur. De test wordt gestart en het lampje stopt met knipperen en blijft continu groen. Wanneer de test klaar is, het lampje uit. Wacht tot het systeem vrijgeeft het deurslot aan het eind van de run, dan opent u de module en verwijder de cartridge. Gooi de gebruikte cartridges in de daarvoor bestemde afvalcontainers op basis van uw instelling standaard praktijken. 5. Representatieve resultaten Elke Xpert MTB / RIF patroon omvat reagentia voor het aantonen van MTB complex RIF weerstand en een monster verwerking (SPC) te controleren voldoende verwerking van het doel bacteriën en de aanwezigheid van inhibitor (s) monitoren van de PCR reactie . De Probe Check Control (PCC) controleert reagens rehydratie, PCR buis in te vullende cartridge probe integriteit en kleurstof stabiliteit. 9 primers in het Xpert MTB / RIF assay amplificeren een deel van de rpoB gen dat de 81 basenparen "kern" gebied. Vijf verschillend gekleurde fluorogene nucleïnezuur hybridisatie probes, de zogenaamde moleculaire bakens, ondervragen de hele 81-bp kern. 14 Elk moleculair beacon is ontworpen om zo specifiek dat het niet binden aan zijn doel als de doelsequentie verschilt van de wild-type rpoB sequentie met slechts een nucleotide substitutie. Aangezien moleculaire bakens fluorescentie alleen wanneer zij gebonden zijn aan hun doelen, namelijk wild-type sequentie rpoB het ontbreken van een van de vijf kleuren in de assay onderscheid tussen wild-type geconserveerde sequentie en mutaties in het kerngebied die geassocieerd zijn met RIF weerstand 6. De SPC moet positief zijn in een negatieve monster en kan negatief of positief zijn in een positief monster. De testresultaat zal zijn "Invalid" als de SPC wordt niet gedetecteerd in een negatieve test. Voor de start van de PCR reactie, de GeneXpert Dx meet de fluorescentiesignaal van de probes te controleren kraal rehydratatie, reactie-buis vulling probe integriteit en kleurstof stabiliteit. De PCC passeert wanneer het fluorescentiesignaal van de probes aan de toegewezen acceptatiecriteria. De resultaten worden geïnterpreteerd door de GeneXpert DX-systeem van de gemeten fluorescentie-signalen en embedded algoritmen en worden weergegeven in het venster 9 Bekijk de resultaten, zoals hieronder aangegeven: MTB gedetecteerd: MTB target-DNA wordt gedetecteerd, beide controles, SPC en PCC, voldoen aan de toegewezen acceptatiecriteria. Lagere Ct-waarden vertegenwoordigen een hogere beginconcentratie van DNA-template; hogere Ct-waarden vertegenwoordigen een lagere concentratie van DNA-template. In MTB GEDETECTEERD resultaten "RIF Resistance gedetecteerd" (Figuur 1A), "RIF Resistance niet mogelijk" ( <strong> Figuur 1B), of "RIF Resistance ONBEPAALDE" wordt weergegeven op een aparte regel. MTB Niet gedetecteerd: MTB target-DNA wordt niet herkend, beide controles, SPC en PCC, voldoen aan de criteria voor acceptatie toegewezen (figuur 2). Ongeldig: Aanwezigheid of afwezigheid van MTB niet kan worden bepaald: SPC voldoet niet aan de criteria voor acceptatie, dat wil zeggen de steekproef niet goed is verwerkt, of PCR werd geremd (figuur 3). Opmerking: Herhaal de test met extra exemplaar! Fout: een of meer van de PCC resultaten mislukt (FAIL). Zowel de MTB en SPC weer te geven geen resultaat. Opmerking: Herhaal de test met extra exemplaar! Als de PCC gepasseerd (PASS), wordt de fout veroorzaakt door een systeem van componenten tot gevolg. Figuur 1: MTB target-DNA wordt gedetecteerd, beide controles, SPC en PCC, voldoen aan de toegewezen acceptatiecriteria. Lagere Ct-waarden vertegenwoordigen een hogere startconcentratie van DNA-template en een hoger Ct-waarden geven een lagere concentratie van DNA-template. In MTB GEDETECTEERD resultaten "RIF Resistance niet mogelijk" (Figuur 1A), "RIF Resistance gedetecteerd" (Figuur 1B), of "RIF Resistance ONBEPAALDE" wordt weergegeven op een aparte regel. . Figuur 1A MTB gedetecteerd; RIF Resistance niet wordt gevonden, dat wil zeggen alleen de wild-type nucleïnezuursequentie van de 81-bp RIF-resistentie-bepalend gebied (RRDR) van de rpoB gen aanwezig was 6. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . . Figuur 1B MTB gedetecteerd; RIF Resistance DETECTED. Compleet uitvallen van Probe B (pijl), die betrekking heeft op de posities 513 tot 517 van de R RDR van de rpoB gen. 6 In het voorbeeld, gedeeltelijke sequentie bleek dat de rpoB genmutatie D516V werd ontdekt. ​​8 Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Figuur 2 MTB-doel-DNA is niet aangetroffen;.. Beide knoppen, SPC en PCC, voldoen aan de toegewezen acceptatiecriteria Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . . Figuur 3 ongeldig resultaat, namelijk aanwezigheid of afwezigheid van MTB kan worden bepaald: SPC niet aan acceptatiecriteria, omdat het monster niet goed verwerkt, of omdat PCR werd geremd.3547fig3large.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere afbeelding weer te geven.