Diagnose Lungentuberkulose mit dem Xpert MTB / RIF-Test

Standard 2 von den Internationalen Standards für Tuberkulose Pflege besagt, dass alle Patienten mit Verdacht auf Lungen-TB mindestens zwei Sputum Proben zur bakteriologischen Untersuchung vorlegen sollte. Wenn möglich, sollte mindestens ein Early-Morning-Probe erhalten werden, wie Sputum in dieser Zeit gesammelt hat den höchsten Ertrag. 11. Der Xpert MTB / RIF-Test auf Sputum-Proben oder konzentrierten Sedimenten aus Sputum oder induzierten Sputum ausgehustet werden, die bereit sind, angewendet werden kann . entweder säurefesten Bazillen (AFB) Abstrich positiv oder negativ 6, 12, 13 Der Test ist für den Gebrauch mit Proben von Patienten, für die es klinischem Verdacht auf Lungen-TB, die haben bestimmt: 1) nicht empfangen Anti-Tuberkulose-Therapie, 2 ) hatte <7 Tagen nach der Therapie, oder 3) haben keine Therapie in den letzten 60 Tagen erhalten haben. Sie beachten, dass es nicht zur Überwachung der Auswirkungen der medikamentösen Therapie 7, weil bakterielle DNA nach antimikrobieller Therapie weiterhin verwendet werden könnten. <pclass = "jove_content"> Behandle klinischen Proben, einschließlich der verwendeten Patronen, als potentiell infektiös zu behandeln. Verwenden Sie die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Schutzkleidung Einweghandschuhe, Laborkittel und Schutzbrillen, und folgen Sie Ihrer Institution Sicherheit Verfahren und Richtlinien. 1. Sputum Proben Hinweis: Prozess nur so viele Proben auf einmal, denn es gibt GeneXpert DX-System-Module zur Verfügung, um den Test laufen! Beschriften Sie jede Xpert MTB / RIF-Patrone mit der entsprechenden ID-Probe. Transfer 1.0 ml Sputum zu einer konischen, Röhrchen mit Schraubverschluss mit einem sterilen Transferpipette. Alternativ kann die gesamte Probe in der ursprünglichen dicht Sputum Sammelbehälter verarbeitet werden. Fügen Sie 2,0 ml Xpert MTB / RIF Probe-Reagenz (2:1; v / v) auf die Sputum mit einer sterilen Transferpipette. Setzen Sie den Deckel, und schütteln Sie das Röhrchen kräftig 10-20 Mal. Alternativ kann die Mischung verwirbelt (30 sec). Willkommen sind das Rohr aufrecht zu stehen für 5 min bei Raumtemperatur. Schütteln Sie das Röhrchen kräftig 10-20 mal. Alternativ können Sie auch einen Wirbel (30 sec). Willkommen sind das Rohr aufrecht zu stehen für weitere 10 min bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie die Proben: Proben sollten ohne sichtbare Klumpen von Sputum verflüssigt werden. 2. Konzentrierte Sedimente Hinweis: Prozess nur so viele Proben auf einmal, wie es GeneXpert DX-System-Module zur Verfügung, um die Tests laufen! Beschriften Sie jede Xpert MTB / RIF-Patrone mit der entsprechenden ID-Probe. Übertragen Sie 1,5 ml Xpert MTB / RIF Probe-Reagenz zu einer konischen, Röhrchen mit Schraubverschluss mit einem sterilen Transferpipette. Fügen Sie mindestens 0,5 ml konzentrierte Sediment zum Beispiel Reagenz, das Rohr mit einer sterilen Transferpipette. Setzen Sie den Deckel, und schütteln Sie die Röhre vigorously 10-20 mal. Alternativ können Sie auch einen Wirbel (30 sec). Willkommen sind das Rohr aufrecht zu stehen für 5 min bei Raumtemperatur. Schütteln Sie das Röhrchen kräftig 10-20 mal. Alternativ können Sie auch einen Wirbel (30 sec). Willkommen sind das Rohr aufrecht zu stehen für weitere 10 min bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie die Proben: Proben sollten ohne sichtbare Klumpen von Sputum verflüssigt werden. 3. Das Laden des Xpert MTB / RIF-Cartridge Hinweis: Starten Sie den Test innerhalb von 30 Minuten Zugabe der Probe in der Patrone! Prüfen Sie die Etiketten auf der Xpert MTB / RIF-Kartusche und der Probe-ID. Öffnen Sie die Patrone Deckel. Mit dem sterilen Transferpipette vorgesehen, saugen Sie den verflüssigten Probe in die Pipette, bis der Meniskus ist über der Mindestpunktzahl und übertragen Sie die Probe in den offenen Port des Xpert MTB / RIF-Patrone. Hinweis:Dosiernadel langsam, um das Risiko der Bildung von Aerosolen zu minimieren! Schließen Sie die Patrone Deckel. 4. Starten des Tests Hinweis: Bevor Sie den Test, sicherzustellen, dass die GeneXpert DX-System mit dem GX2.1 Software ausgestattet, und der Xpert MTB / RIF-Test wird in die Software importiert 9! Schalten Sie den Computer und dann auf der GeneXpert Dx Instrument ein. Auf dem Windows-Desktop, doppelklicken Sie auf das GeneXpert Dx Shortcut-Symbol. Melden Sie sich am GeneXpert DX-System-Software mit Ihrem Benutzernamen und Passwort an. In der DX-System GeneXpert Fenster klicken Sie auf Test erstellen. Die Scan-Cartridge Barcode-Dialogbox erscheint. Im Sample-Feld ID scannen oder geben Sie den Proben-ID. Scannen Sie den Barcode auf dem Xpert MTB / RIF-Patrone. Der Test erstellen wird angezeigt. Klicken Sie auf Test starten </strong>, und geben Sie Ihr Kennwort in das Dialogfeld, das angezeigt. Öffnen Sie das Gerät mit dem Modul Tür blinkendes grünes Licht, und laden Sie die Patrone. Schließen Sie die Tür. Der Test beginnt und das Licht aufhört zu blinken und ständig grün. Wenn der Test abgeschlossen ist, schaltet sich das Licht aus. Warten Sie, bis das System löst das Türschloss am Ende des Laufes, öffnen Sie dann das Modul Tür und entfernen Sie die Patrone. Entsorgen Sie verbrauchte Patronen in den entsprechenden Abfallbehältern nach Ihrer Institution üblichen Verfahren. 5. Repräsentative Ergebnisse Jeder Xpert MTB / RIF Patrone Reagenzien zum Nachweis der MTB-Komplex und RIF Beständigkeit sowie einer Probe Prozesskontrolle (SPC) für eine angemessene Verarbeitung der Target-Bakterien zu kontrollieren und die Gegenwart von Inhibitor (en) in der PCR-Reaktion zu überwachen . Die Sonde Check-Control (PCC) überprüft Reagenz Rehydratation, PCR-Röhrchen füllendie Patrone, zu verstärken Sonde Integrität und Farbstabilität. 9 Die Primer in der Xpert MTB / RIF-Assay einen Teil des Gens rpoB enthält die 81-Basenpaar "Kern"-Region. Fünf unterschiedlich farbigen fluorogenen Nukleinsäure-Hybridisierungssonden, genannt Molecular Beacons, fragt den gesamten 81-bp-Kern. 14 Jede Molecular Beacon wurde entwickelt, um so spezifisch, daß es nicht sein Ziel zu binden, wenn die Zielsequenz unterscheidet sich von dem Wildtyp-rpoB Sequenz durch so wenig wie ein Einzel-Nukleotid-Substitution. Da Molecular Beacons Fluoreszenz nur, wenn sie ihre Ziele, dh Wildtyp-Sequenz rpoB gebunden sind, die Abwesenheit von einem der fünf Farben in dem Test zwischen dem konservierten Wildtyp-Sequenz und Mutationen zu unterscheiden in der Kernregion die assoziiert sind mit RIF Widerstand. 6 Die SPC sollten in einer negativen Probe positiv und kann negativ oder positiv sein in einer positiven Probe. Der TestErgebnis wird sein, "Ungültig", wenn der SPC wird nicht zu einem negativen Test nachgewiesen. Vor Beginn der PCR-Reaktion, misst das GeneXpert DX-System das Fluoreszenzsignal von den Sonden zu Wulst Rehydratisierung, Reaktions-Rohrfüllung, Sonde Integrität und Farbstabilität zu überwachen. Die PCC ist erfolgreich, wenn die Fluoreszenz-Signal von den Sonden erfüllt die Aufnahmekriterien zugewiesen. Die Ergebnisse von der GeneXpert DX-System von den gemessenen Fluoreszenz-Signale und Embedded Berechnungsalgorithmen werden interpretiert und sind in der View Results Fenster 9 angezeigt, wie unten angegeben: MTB Detected: MTB Ziel-DNA erkannt wird; beide Regler, SPC und PCC, erfüllen die Aufnahmekriterien zugewiesen. Untere Ct-Werte stellen eine höhere Ausgangskonzentration von DNA-Matrize, höhere Ct-Werte stellen eine geringere Konzentration an DNA-Matrize. Im MTB detektierten Ergebnisse "RIF Widerstand erkannt" (Abbildung 1A), "RIF Widerstand nicht erkannt" ( <strong> Abbildung 1B), oder "RIF Widerstand unbestimmt" wird in einer eigenen Zeile angezeigt werden. MTB nicht erkannt: MTB-Ziel-DNA wird nicht erkannt, beide Kontrollen, SPC und PCC, erfüllen die Aufnahmekriterien zugewiesen (Abbildung 2). Ungültig: Das Vorhandensein oder Fehlen von MTB nicht ermittelt werden kann: SPC nicht erfüllt Akzeptanzkriterien, dh die Probe nicht richtig verarbeitet wurde, oder PCR inhibiert wurde (Abbildung 3). Hinweis: wiederholen Sie den Test mit extra Probe! Fehler: Ein oder mehrere der PCC Ergebnisse gescheitert (FAIL). Sowohl MTB-und SPC-Anzeige Kein Ergebnis. Hinweis: wiederholen Sie den Test mit extra Probe! Wenn die PCC übergeben (PASS), wird der Fehler von einer Systemkomponente Fehler verursacht hat. Abbildung 1: MTB-Ziel-DNA erkannt wird; beide Regler, SPC und PCC, erfüllen die Aufnahmekriterien zugewiesen. Niedrigere Ct Werte stellen eine höhere Anfangs-Konzentration von DNA-Matrize, höhere Ct-Werte stellen eine geringere Konzentration an DNA-Matrize. Im MTB detektierten Ergebnisse "RIF Widerstand nicht erkannt" (Abbildung 1A), "RIF Widerstand erkannt" (Abbildung 1B), oder "RIF Widerstand unbestimmt" wird in einer eigenen Zeile angezeigt werden. . 1A MTB nachgewiesen; RIF Widerstand nicht erkannt wird, dh nur die Wildtyp-Nukleinsäuresequenz des 81-bp-RIF Widerstand bestimmenden Region (RRDR) des Gens rpoB anwesend war 6. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen . . Abbildung 1B MTB nachgewiesen; RIF Widerstandes erfasst. Füllen Sie brechen die Probe B (Pfeil), die deckt die Positionen 513 bis 517 des R RDR des Gens rpoB. 6 Im Beispiel partielle Sequenzierung ergab, dass die Gen-Mutation D516V rpoB erkannt wurde. 8 Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen . Abbildung 2 MTB-Ziel-DNA wurde nicht erkannt,.. Beide Regler, SPC und PCC, erfüllen die Aufnahmekriterien zugeordnet Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen . . 3 Ungültig Testergebnis, dh Anwesenheit oder Abwesenheit von MTB nicht ermittelt werden kann: SPC nicht erfüllt Akzeptanzkriterien, weil die Probe nicht richtig verarbeitet, oder weil PCR gehemmt wurde.3547fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.