ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי
Summary
גישה לנתח את ההגירה של תאים (תאי explanted רכס עצביים גזע) הוא תאר. שיטה זו היא זולה, עדינה, ומסוגלת להבחין chemotaxis משני chemokinesis והשפעות אחרות על קוטביות נדידה כגון אלה נגזרים מאינטראקציות תא תא בתוך התרבות העיקרית הגזע עצבי פסגת התא.
Abstract
תאי רכס עצביים (NCCs) הם אוכלוסייה זמנית של תאים הנמצאים בפיתוח חוליות שלהגר מצינור העצבי הגבה (NT) לאחר שעבר 1,2 מעבר אפיתל-mesenchymal. בעקבות EMT, NCCs לנדוד מרחקים גדולים לאורך מסלולים סטריאוטיפיים עד שהם מגיעים ליעדיהם. NCCs להתמיין למגוון רחב של סוגי תאים, כוללים תאי עצב, גליה המלנוציטים, תאי 1-3 chromaffin. היכולת של NCCs להגיע ולהכיר מקומות היעד הנכונים שלהם היא יסוד להיווצרות המתאימה של כל המבנים המכילים תא מטען נגזר NCC-3 מרכיבים. הבהרת מנגנוני ההדרכה לגזע NCC הגירה הייתה אפוא עניין בעל חשיבות רבה. מולקולות רבות שהפגינו להדריך NCC הגירת 4. לדוגמה, NCCs גזע ידוע להיות דחוי על ידי רמזי הדרכה שליליים כגון Semaphorin, Ephrin, וligands חריץ 5-8. עם זאת, לאעד לאחרונה היה לי chemoattractants של NCCs מטען זוהה 9.
גישות קונבנציונליות במבחנה ללימוד התנהגות chemotactic של תאי חסיד עבודה הטובה ביותר עם תאים הנציחו, homogenously מופץ, אך מאתגרים יותר לפנות לתרבויות מסוימות העיקריות בתאי גזע שתחילה חסרות הפצה הומוגני ומהירות להבדיל (כגון NCCs). גישה אחת לומוגני חלוקת NCCs מטען ללימודי chemotaxis היא לבודד NCCs גזע מתרבויות explant NT העיקריות, ואז להרים וreplate להיות כמעט 100% confluent. עם זאת, גישה זו דורשת ציפוי כמויות ניכרות של זמן ומאמץ כדי explant מספיק תאים, היא קשה, ומפיצת NCCs מטען באופן שונה מזו שנמצא בתנאי vivo.
כאן, אנו מדווחים גישה במבחנה כי הוא מסוגל להעריך את התגובות נודדות Chemotaxis ואחרות של NCCs מטען ללא requirinGA חלוקת תא הומוגנית. טכניקה זו מנצלת הדמיה זמן לשגות של ראשוני, ואינה נרתעת NCCs מטען בתוך modified Zigmond קאמרי (קאמרי Zigmond סטנדרטי מתואר במקום אחר 10). על ידי חשיפת NCCs מטען בפריפריה של התרבות לשיפוע chemotactant שניצבת ליווניות הטבעיות חזו, שינויים בקוטביות נודדת הנגרמים על ידי שיפוע chemotactant מיושם ניתן לאתר. טכניקה זו היא זולה, דורשת culturing של רק שני explants NT לטיפול לשכפל, נמנע מהרמת תא קשה (כגון trypsinization), משאיר NCCs מטען בהפצה דומה יותר לתנאי vivo, חותך את כמות הזמן בין explantation וניסויים (שסביר להניח מפחית את הסיכון לבידול), ומאפשר הערכת זמן לשגות של מאפיינים נודדים רבים.
Protocol
Discussion
מחקר chemotaxis על NCCs הגזע הוכיח מאתגר עבור סדרה של סיבות. NCCs Trunk מהווה אוכלוסייה הטרוגנית של תאי גזע שתתמיין ואם תרבותי לטווח ארוך, ולכן יש לקבל NCCs הגזע מexplantation העיקרי של NT תא מטען ברמה. שיטות מקובלות ללימוד תגובת chemotactic של אוכלוסיות תאים חולקו homogenously במבחנה קשות לבדו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו נותנים תודה מיוחדת ללינוי קים, סטיב גוזמן וUjit Satyarthi לסיוע טכני במהלך הפיתוח של שיטה זו. מיירון הות'ורן, ריצ'רד Spengel, ורוברטו רוחאס מכונת התאים משמשים כאן וספקו סיוע טכני נחוץ. יש לציין, רוברטו רוחאס הופק איור 4. אנחנו גם אסירת תודה על העצות היקרות הערך של סקוט פרייזר לקראת הפיתוח של assay chemotaxis לעיל. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי SCORE-5S06GM048680-13-NIH MBRS לMEdB ופרס מהמחלקה לזיהוי הפלילי, תכנית תמיכת תזת בוגר Northridge לCW.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Omega Scientific | DM-22 | |
| Penicillin Streptomycin Solution | Omega Scientific | PS-20 | 100X Stock Concentration |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 100X Stock Concentration |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Lot# 105247 (or another that is comparable) |
| Modified Zigmond chamber | Home made | N/A | Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol |
| Cell culture dish | Denville | T6040 | 40 x 10 mm |
| Fibronectin | BD | 354008 | 10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | Precleaned; 22 x 22 mm |
| L15 medium | Thermo Scientific | SH30525.02 | |
| Petroleum Jelly | Comforts | 011110794642 | 100% |
| Centrifuge tube | Biologix | 10-9152 | 15 ml |
| Dispase | Cell Systems | 4Z0-850 | 10X Stock Concentration |
| Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
| Needle | BD | 305127 | 25 G x 1.5 in. |
| Alexa Fluor 488-IgM | Invitrogen | A21042 | Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM |
| Dissecting Forceps | FST | Misc. | Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium |
| Tungsten Needle | N/A | N/A | Home made; placed in a pin holder |
| Blunt Forceps | Tiemann | 160-18 | Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk |
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:
- Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
- Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
- Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
- Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
- Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
- Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
- Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
- Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
- Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.
References
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Baker, C. V. . Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).
- Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. Division of labor during trunk neural crest development. Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).
- Wang, H. U., Anderson, D. J. Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth. Neuron. 18, 383-396 (1997).
- Krull, C. E. Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration. Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).
- Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).
- De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells. The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).
- Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells. J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chicken embryo. J. Morph. 88, 49-52 (1951).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Davis, E. M., Trinkaus, J. P. Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).
