Analyse van Trunk neurale cel migratie met behulp van een gewijzigd Zigmond Kamer Assay
Summary
Een benadering om de migratie van cellen geëxplanteerde (trunk neurale cellen) analyseren beschreven. Deze methode is goedkoop, zacht en kunnen onderscheiden chemotaxis van zowel chemokinesis en andere invloeden op trekkende polariteit zoals die afgeleid van cel-cel interacties in de primaire neurale stam celkweek.
Abstract
Neurale cellen (NCC) een voorbijgaande populatie van cellen in de ontwikkeling van vertebraten die uit de dorsale neurale buis (NT) NZ na het ondergaan van een epitheliale-mesenchymale transitie 1,2. Na EMT, NCC's migreren grote afstanden langs stereotype paden totdat ze hun doelstellingen. NCC's differentiëren tot een breed scala aan celtypes waaronder neuronen, glia, melanocyten, en chromaffin cellen 1-3. Het vermogen van NCC's te bereiken en herkennen hun juiste doellocaties is fundamenteel voor de juiste vorming van alle structuren die trunk NCC-afgeleide componenten 3. Het ophelderen van de mechanismen van begeleiding voor romp NCC migratie is dan ook een kwestie van grote betekenis. Talrijke moleculen zijn gebleken NCC migratie 4 leiden. Zo worden trunk NCC's bekend te worden afgestoten door negatieve begeleiding signalen zoals Semaphorin, Efrine, en Slit liganden 5-8. Echter niettot voor kort geen chemoattractanten van stam NCC geïdentificeerd 9.
Conventionele benaderingen in vitro bestuderen van het gedrag van chemotactische hechtende cellen werken beste geïmmortaliseerd, homogeen verdeeld cellen, maar moeilijker om voor bepaalde primaire stamcelculturen die aanvankelijk missen een homogene verdeling en snel differentiëren (bijvoorbeeld NCC). Een benadering voor de verdeling van stam NCC voor chemotaxis studies meng is trunk NCC isoleren van primaire NT explantaat culturen til en replate ze bijna 100% confluent. Echter, deze plating aanpak vereist aanzienlijke hoeveelheden tijd en moeite om voldoende cellen explanteren, is hard, en distribueert romp nationale centra voor valsemunterij op een ongelijke wijze als in in vivo omstandigheden.
Hier rapporteren we een in vitro methode die in staat is chemotaxis en andere migrerende reacties van stam NCC evalueren zonder requirinGA homogene cel distributie. Deze techniek maakt gebruik van time-lapse imaging van de primaire, romp NCC onverstoord in een gemodificeerde Zigmond kamer (een standaard Zigmond kamer wordt elders 10 beschreven). Door belichting stam NCC aan de omtrek van de cultuur een chemotactant gradiënt loodrecht op hun voorspelde natuurlijke richtinggevoeligheid kunnen veranderingen in trekkende polariteit opgewekt door de toegepaste gradiënt chemotactant worden gedetecteerd. Deze techniek is goedkoop, vereist het kweken van twee NT explantaten per herhaling behandeling vermijdt harde cel heffen (zoals trypsine), bladeren trunk NCC in een soortgelijke verdeling in vivo omstandigheden, vermindert de hoeveelheid tijd tussen explantatie en experimenten (waardoor waarschijnlijk het risico van differentiatie), en maakt time-lapse evaluatie van talrijke trekkende eigenschappen.
Protocol
Discussion
Het uitvoeren van chemotaxis onderzoek op stam NCC heeft bewezen een uitdaging voor een aantal redenen. Trunk NCC's vormen een heterogene stamcel populatie die zal differentiëren als gekweekte lange termijn, daarom romp NCC's moet worden verkregen van de primaire explantatie van de stam-niveau NT. Conventionele methoden om de chemotactische respons van homogeen verdeeld celpopulaties in vitro bestuderen zijn moeilijk te testen op stam NCC omdat ze eerst dient cellen geïsoleerd en homogeen opnieuw uitg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We geven speciale dank aan Lino Kim, Steve Guzman en Ujit Satyarthi voor technische bijstand bij de ontwikkeling van deze methode. Myron Hawthorne, Richard Spengel, en Roberto Rojas bewerkt de kamers hier gebruikt en op voorwaarde dat de broodnodige technische bijstand. Met name Roberto Rojas geproduceerd Figuur 4. We zijn ook dankbaar voor waardevolle adviezen Scott Fraser voorafgaand aan de ontwikkeling van de hierboven chemotaxis assay. Dit werk werd mede ondersteund door een NIH-MBR SCORE-5S06GM048680-13 om Medb en door een prijs van de CSU, Northridge Graduate Thesis Support Program aan CW.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Omega Scientific | DM-22 | |
| Penicillin Streptomycin Solution | Omega Scientific | PS-20 | 100X Stock Concentration |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 100X Stock Concentration |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Lot# 105247 (or another that is comparable) |
| Modified Zigmond chamber | Home made | N/A | Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol |
| Cell culture dish | Denville | T6040 | 40 x 10 mm |
| Fibronectin | BD | 354008 | 10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | Precleaned; 22 x 22 mm |
| L15 medium | Thermo Scientific | SH30525.02 | |
| Petroleum Jelly | Comforts | 011110794642 | 100% |
| Centrifuge tube | Biologix | 10-9152 | 15 ml |
| Dispase | Cell Systems | 4Z0-850 | 10X Stock Concentration |
| Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
| Needle | BD | 305127 | 25 G x 1.5 in. |
| Alexa Fluor 488-IgM | Invitrogen | A21042 | Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM |
| Dissecting Forceps | FST | Misc. | Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium |
| Tungsten Needle | N/A | N/A | Home made; placed in a pin holder |
| Blunt Forceps | Tiemann | 160-18 | Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk |
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:
- Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
- Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
- Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
- Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
- Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
- Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
- Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
- Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
- Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.
References
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Baker, C. V. . Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).
- Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. Division of labor during trunk neural crest development. Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).
- Wang, H. U., Anderson, D. J. Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth. Neuron. 18, 383-396 (1997).
- Krull, C. E. Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration. Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).
- Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).
- De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells. The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).
- Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells. J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chicken embryo. J. Morph. 88, 49-52 (1951).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Davis, E. M., Trinkaus, J. P. Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).
