El análisis de la migración de células troncales neurales Crest utilizando una versión modificada del ensayo Zigmond Cámara
Summary
Un enfoque para analizar la migración de las células explantados (células troncales de la cresta neural) se describe. Este método es barato, amable y capaz de distinguir la quimiotaxis de los dos quimiocinesis y otras influencias en la polaridad migratorias, como las derivadas de las interacciones célula-célula en el tronco principal cultivo de células neuronales de la cresta.
Abstract
Las células de la cresta neural (CCN) son una población transitoria de células presentes en el desarrollo de vertebrados que emigrar del tubo neural dorsal (NT) tras someterse a un 1,2 transición epitelio-mesenquimal. Después de la EMT, los países contribuyentes netos migrar grandes distancias a lo largo de las vías estereotipados hasta alcanzar sus objetivos. NCC diferenciarse en una amplia gama de tipos de células incluyendo neuronas, células gliales, los melanocitos, células cromafines y 1-3. La capacidad de los países contribuyentes netos para alcanzar y reconocer a sus lugares de destino adecuado es fundamental para la formación adecuada de todas las estructuras que contienen tronco NCC componentes derivados 3. Elucidar los mecanismos de orientación para el tronco NCC migración ha sido por lo tanto, una cuestión de gran importancia. Numerosas moléculas se ha demostrado que guía la migración NCC 4. Por ejemplo, los países contribuyentes netos tronco se sabe que son repelidos por las señales negativas como la orientación semaforina, efrina, y ligandos de hendidura 5-8. Sin embargo, nohasta hace poco cualquier quimiotácticos de los países contribuyentes netos tronco se han identificado 9.
Convencionales métodos in vitro para estudiar el comportamiento quimiotáctico de células adherentes mejor trabajar con inmortalizado, las células homogéneamente distribuidos, pero son más difíciles de aplicar a ciertos cultivos primarios de células madre que inicialmente carecen de una distribución homogénea y diferenciar rápidamente (por ejemplo, los países contribuyentes netos). Un enfoque para homogeneizar la distribución de los países contribuyentes netos del tronco de los estudios de quimiotaxis es aislar a los países contribuyentes netos tronco de cultivos primarios de explantes NT, a continuación, levante y replate a ser casi el 100% confluente. Sin embargo, este enfoque requiere de placas grandes cantidades de tiempo y esfuerzo para explante número suficiente de células, es duro, y distribuye los países contribuyentes netos del tronco de una manera diferente a la que se encuentra en condiciones in vivo.
Aquí, se presenta un enfoque in vitro que es capaz de evaluar la quimiotaxis y otras respuestas migratorias de los países contribuyentes netos tronco sin requiringa la distribución de células homogéneas. Esta técnica utiliza imágenes a intervalos de tiempo de la primaria, imperturbable NCC tronco dentro de una cámara modificada Zigmond (una cámara estándar de Zigmond se describe en otro 10). Mediante la exposición de los países contribuyentes netos del tronco en la periferia de la cultura a un gradiente de chemotactant que es perpendicular a su direccionalidad predijo naturales, las alteraciones en la polaridad migratorios inducidos por el gradiente de chemotactant aplicada puede ser detectado. Esta técnica es de bajo costo, requiere el cultivo de sólo dos explantes por tratamiento NT replicar, evita la elevación de células duras (por ejemplo, tripsina), las hojas de los países contribuyentes netos tronco en una distribución más similar a las condiciones in vivo, reduce la cantidad de tiempo que transcurre entre la explantación y la experimentación (lo que probablemente reduce el riesgo de diferenciación), y permite lapso de tiempo la evaluación de numerosas características migratorias.
Protocol
Discussion
La realización de investigaciones sobre la quimiotaxis de los países contribuyentes netos tronco ha demostrado ser un reto para una serie de razones. NCC tronco constituyen una población heterogénea de células madre que va a diferenciar si se cultivan a largo plazo, por lo tanto, los países contribuyentes netos tronco ha de ser obtenida de la explantación de la primaria del tronco a nivel de NT. Los métodos convencionales para estudiar la respuesta quimiotáctica de las poblaciones de células distribuidas homog…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos un agradecimiento especial a Lino Kim, Steve Guzmán y Satyarthi UJIT de asistencia técnica durante el desarrollo de este método. Myron Hawthorne, Spengel Richard, Rojas y Roberto máquina las cámaras utilizadas aquí y siempre muy necesaria asistencia técnica. Cabe destacar que, Roberto Rojas produjo la Figura 4. También estamos agradecidos por valiosos consejos de Scott Fraser, antes del desarrollo de la prueba de la quimiotaxis de arriba. Este trabajo fue apoyado en parte por un marcador-5S06GM048680-13 NIH-SAM para Medb y por un premio de la CSU Programa, Northridge apoyo de tesis de grado para CW.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Omega Scientific | DM-22 | |
| Penicillin Streptomycin Solution | Omega Scientific | PS-20 | 100X Stock Concentration |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 100X Stock Concentration |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Lot# 105247 (or another that is comparable) |
| Modified Zigmond chamber | Home made | N/A | Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol |
| Cell culture dish | Denville | T6040 | 40 x 10 mm |
| Fibronectin | BD | 354008 | 10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | Precleaned; 22 x 22 mm |
| L15 medium | Thermo Scientific | SH30525.02 | |
| Petroleum Jelly | Comforts | 011110794642 | 100% |
| Centrifuge tube | Biologix | 10-9152 | 15 ml |
| Dispase | Cell Systems | 4Z0-850 | 10X Stock Concentration |
| Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
| Needle | BD | 305127 | 25 G x 1.5 in. |
| Alexa Fluor 488-IgM | Invitrogen | A21042 | Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM |
| Dissecting Forceps | FST | Misc. | Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium |
| Tungsten Needle | N/A | N/A | Home made; placed in a pin holder |
| Blunt Forceps | Tiemann | 160-18 | Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk |
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:
- Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
- Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
- Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
- Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
- Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
- Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
- Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
- Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
- Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.
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