Analyse der Trunk Neural Crest Cell Migration mit Hilfe eines modifizierten Zigmond Chamber Assay
Summary
Ein Ansatz, um die Migration von explantierten Zellen (Stamm Neuralleistenzellen) analysieren beschrieben. Dieses Verfahren ist kostengünstig, leicht, und in der Lage zu unterscheiden Chemotaxis sowohl Chemokinese und andere Einflüsse auf wandernde Polarität wie die von Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb des primären Stamm Neuralleiste Zellkultur abgeleitet.
Abstract
Neuralleistenzellen (NCC) ist eine transiente Population von Zellen, die in Entwicklung von Wirbeltieren, dass aus dem dorsalen Neuralrohr (NT) auswandern nach Durchlaufen eines epithelial-mesenchymale Transition 1,2. Nach EMT, migrieren NCCs große Entfernungen entlang stereotypes Wege, bis sie ihre Ziele zu erreichen. NCCs differenzieren sich in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia, Melanozyten und Chromaffinzellen 1-3. Die Fähigkeit von NCCs zu erreichen und erkennen ihre richtigen Zielregionen für die entsprechende Ausbildung aller Strukturen mit trunk NCC-abgeleiteten Komponenten 3 grundlegend. Aufklärung der Mechanismen von Leitlinien für Trunk NCC Migration hat deshalb eine Angelegenheit von großer Bedeutung. Zahlreiche Moleküle nachgewiesen, dass NCC Migration 4 führen. Beispielsweise werden Trunk NCCs bekanntermaßen von negativen Führung Zeitgeber wie Semaphorin, Ephrin und Slit Liganden 5-8 abgestoßen werden. Allerdings sind nichtbis vor kurzem keine Lockstoffe des Rumpfes NCCs identifiziert worden 9.
Herkömmliche Ansätze zur in vitro Untersuchung der chemotaktischen Verhalten von adhärenten Zellen funktionieren am besten mit immortalisierten, homogen verteilt Zellen, sind jedoch schwieriger zu bestimmten primären Stammzellkulturen die zunächst fehlt eine homogene Verteilung und rasch zu unterscheiden (wie NCCs) anzuwenden. Ein Ansatz, um die Verteilung der Stamm NCCs für Chemotaxisstudien homogenisieren ist die Trunk NCCs aus primären NT Explantatkulturen isolieren, dann heben und replate ihnen zu fast 100% konfluent. Dies erfordert jedoch plating Ansatz erhebliche Mengen an Zeit und Mühe, um genügend Zellen Explantation, ist hart und vertreibt trunk NCCs in einem ungleichen Weise wie in in vivo-Bedingungen gefunden.
Hier berichten wir über eine in vitro Ansatz, der in der Lage, Chemotaxis und andere wandernde Reaktionen des Rumpfes NCCs ohne requirin bewerten istga homogene Zellverteilung. Diese Technik nutzt Zeitraffer-Aufnahmen von primären, unbeirrt trunk NCCs in einem modifizierten Zigmond Kammer (ein Standard Zigmond Kammer wird an anderer Stelle 10 beschrieben). Durch Belichten Trunk NCCs am Umfang der Kultur auf eine chemotactant Gradienten, die senkrecht zu ihrer vorhergesagten natürliche Richtung, können Veränderungen in wandernden Polarität durch die angelegte chemotactant Gradienten induzierte detektiert werden. Diese Technik ist kostengünstig, erfordert das Züchten von nur zwei NT je Wiederholung Explantate Behandlung vermeidet rauen Zelle Anheben (wie Trypsinisierung) verlässt Trunk NCCs in eine ähnliche Verteilung in vivo-Bedingungen, verkürzt sich die Zeitspanne zwischen Explantation und Experimente (was wahrscheinlich verringert das Risiko der Differenzierung), und ermöglicht Zeitraffer Auswertung zahlreicher wandernden Merkmale.
Protocol
Discussion
Dirigieren Chemotaxis Forschung am Stamm NCCs erwiesen Herausforderung für eine Reihe von Gründen. Trunk NCCs sind eine heterogene Stammzellen Bevölkerung unterscheiden, ob kultivierten langfristigen wird, daher trunk NCCs aus primären Explantation des Stamm-Ebene NT eingeholt werden muss. Herkömmliche Verfahren, die chemotaktische Reaktion von homogen verteilt Zellpopulationen in vitro zu untersuchen sind schwierig auf Trunk NCCs testen, da sie zuerst erforderlich, dass Zellen getrennt und homogen wiederp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir geben besonderen Dank an Lino Kim, Steve Guzman und Ujit Satyarthi für die technische Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode. Myron Hawthorne, Richard Spengel und Roberto Rojas bearbeitet die Kammern verwendet hier und dringend benötigte technische Unterstützung. Bemerkenswert ist, produziert Roberto Rojas Abbildung 4. Wir sind auch dankbar für wertvolle Ratschläge Scott Fraser vor der Entwicklung der oben genannten Chemotaxis Assay. Diese Arbeit wurde teilweise durch eine NIH-MBRS SCORE-5S06GM048680-13 bis MEDB und durch eine Auszeichnung von der CSU, Northridge Diplomarbeit Support Program CW unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Omega Scientific | DM-22 | |
| Penicillin Streptomycin Solution | Omega Scientific | PS-20 | 100X Stock Concentration |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 100X Stock Concentration |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Lot# 105247 (or another that is comparable) |
| Modified Zigmond chamber | Home made | N/A | Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol |
| Cell culture dish | Denville | T6040 | 40 x 10 mm |
| Fibronectin | BD | 354008 | 10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | Precleaned; 22 x 22 mm |
| L15 medium | Thermo Scientific | SH30525.02 | |
| Petroleum Jelly | Comforts | 011110794642 | 100% |
| Centrifuge tube | Biologix | 10-9152 | 15 ml |
| Dispase | Cell Systems | 4Z0-850 | 10X Stock Concentration |
| Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
| Needle | BD | 305127 | 25 G x 1.5 in. |
| Alexa Fluor 488-IgM | Invitrogen | A21042 | Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM |
| Dissecting Forceps | FST | Misc. | Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium |
| Tungsten Needle | N/A | N/A | Home made; placed in a pin holder |
| Blunt Forceps | Tiemann | 160-18 | Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk |
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:
- Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
- Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
- Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
- Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
- Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
- Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
- Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
- Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
- Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.
References
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