An approach to analyze the migration of explanted cells (trunk neural crest cells) is described. This method is inexpensive, gentle, and capable of distinguishing chemotaxis from both chemokinesis and other influences on migratory polarity such as those derived from cell-cell interactions within the primary trunk neural crest cell culture.
Cellules de la crête neurale (CCN) sont une population de passage de cellules présentes dans le développement des vertébrés qui émigrent à partir du tube neural dorsal (NT) après avoir subi une 1,2 transition épithélio-mésenchymateuses. Après EMT, CNC migrer de grandes distances le long des voies stéréotypés jusqu'à ce qu'ils atteignent leurs objectifs. CNC se différencier en un vaste éventail de types de cellules, y compris les neurones, cellules gliales, les mélanocytes et les cellules chromaffines 1-3. La capacité du CNC à atteindre et à reconnaître leurs emplacements cible appropriée est fondamentale pour la formation appropriée de toutes les structures contenant le tronc de la CCN composants dérivés 3. Élucider les mécanismes d'orientation pour le tronc de la CCN de migration a donc été un sujet de grande importance. Plusieurs molécules ont été démontrés pour guider la CCN migrations 4. Par exemple, les CNC du tronc sont connus pour être repoussés par des signaux de guidage négatifs tels que Semaphorin, Ephrine et les ligands fente 5-8. Cependant, ne pasjusqu'à récemment toute chimiotactiques du CNC du tronc été identifiés 9.
Conventionnel dans les approches in vitro pour étudier le comportement chimiotactique de cellules adhérentes mieux travailler avec immortalisé, de façon homogène les cellules distribuées, mais sont plus difficiles à appliquer à certaines cultures primaires de cellules souches qui n'ont pas d'abord une distribution homogène et rapide de différencier (comme CNC). Une approche pour homogénéiser la répartition de la CNE du tronc pour les études de chimiotactisme est d'isoler les CNC du tronc de l'enseignement primaire des cultures d'explants NT, puis soulevez et replate qu'ils soient près de 100% de confluence. Cependant, cette approche nécessite plaquage des quantités substantielles de temps et d'effort pour explant suffisamment de cellules, est rude, et distribue des CCN du tronc d'une manière différente à celle trouvée dans des conditions in vivo.
Nous rapportons ici une approche in vitro, qui est en mesure d'évaluer la chimiotaxie et d'autres réponses migratoires des CNC tronc sans requirindistribution de ga cellulaire homogène. Cette technique utilise imagerie time-lapse du primaire, imperturbable CNC tronc intérieur d'une chambre modifiés Zigmond (une chambre standard de Zigmond est décrit ailleurs 10). En exposant CNC tronc à la périphérie de la culture à un gradient de chemotactant qui est perpendiculaire à leur directivité naturelle prédit, des altérations de la polarité migratoires induits par le gradient chemotactant appliquée peut être détecté. Cette technique est peu coûteuse, nécessite la mise en culture d'explants NT seulement deux pour le traitement de reproduire, de levage évite de cellules dures (telles que la trypsine), laisse les CNC malle dans une distribution plus semblable à des conditions in vivo, réduit la quantité de temps entre l'explantation et l'expérimentation (ce qui réduit probablement le risque de différenciation), et permet time-lapse d'évaluation des caractéristiques de nombreux migrateurs.
Conducting chemotaxis research on trunk NCCs has proven challenging for a series of reasons. Trunk NCCs constitute a heterogeneous stem cell population that will differentiate if cultured long-term; therefore, trunk NCCs must be obtained from primary explantation of the trunk-level NT. Conventional methods to study the chemotactic response of homogenously distributed cell populations in vitro are difficult to test on trunk NCCs since they first require that cells are isolated and homogenously replated in …
The authors have nothing to disclose.
We give special thanks to Lino Kim, Steve Guzman and Ujit Satyarthi for technical assistance during the development of this method. Myron Hawthorne, Richard Spengel, and Roberto Rojas machined the chambers used here and provided much-needed technical assistance. Notably, Roberto Rojas produced Figure 4. We are also thankful for Scott Fraser’s invaluable advice prior to the development of the above chemotaxis assay. This work was partly supported by an NIH-MBRS SCORE-5S06GM048680-13 to MEdB and by an award from the CSU, Northridge Graduate Thesis Support Program to CW.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
DMEM | Omega Scientific | DM-22 | |
Penicillin Streptomycin Solution | Omega Scientific | PS-20 | 100X Stock Concentration |
L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 100X Stock Concentration |
Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Lot# 105247 (or another that is comparable) |
Modified Zigmond chamber | Home made | N/A | Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol |
Cell culture dish | Denville | T6040 | 40 x 10 mm |
Fibronectin | BD | 354008 | 10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM |
Coverslips | Fisher | 12-548-B | Precleaned; 22 x 22 mm |
L15 medium | Thermo Scientific | SH30525.02 | |
Petroleum Jelly | Comforts | 011110794642 | 100% |
Centrifuge tube | Biologix | 10-9152 | 15 ml |
Dispase | Cell Systems | 4Z0-850 | 10X Stock Concentration |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Needle | BD | 305127 | 25 G x 1.5 in. |
Alexa Fluor 488-IgM | Invitrogen | A21042 | Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM |
Dissecting Forceps | FST | Misc. | Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium |
Tungsten Needle | N/A | N/A | Home made; placed in a pin holder |
Blunt Forceps | Tiemann | 160-18 | Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk |
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below: