Análise de Tronco de Migração da crista neural celular usando uma modificação Zigmond Ensaio Câmara
Summary
Uma abordagem para analisar a migração de células explantadas (células tronco da crista neural) é descrita. Este método é barato, suave, e é capaz de distinguir a quimiotaxia tanto de quimiocinese e outras influências sobre a polaridade migratórias tais como aqueles derivados de interacções célula-célula dentro da cultura de células primária tronco da crista neural.
Abstract
Células da crista neural (CBCs) são uma população transitória de células presentes no desenvolvimento de vertebrados que emigram do tubo neural dorsal (NT) depois de passar por um 1,2 transição epitelial-mesenquimal. Após EMT, NCCs migrar grandes distâncias ao longo de caminhos estereotipados até que eles atinjam seus alvos. NCCs diferenciar em uma vasta gama de tipos de células incluindo neurónios, glia, melanócitos e células cromafins 1-3. A capacidade do NCC para chegar e reconhecer os seus locais de destino adequados é fundamental para a formação adequada de todas as estruturas que contêm NCC-tronco derivadas de componentes 3. Elucidar os mecanismos de orientação para o tronco NCC migração tem sido, portanto, uma questão de grande importância. Numerosas moléculas têm sido demonstrados para orientar a migração NCC 4. Por exemplo, os CBCs tronco são conhecidos por ser repelida por pistas de orientação negativas, tais como Semaforina, Efrina, e ligandos de fenda 5-8. No entanto, nãoaté recentemente tem quimioatractivos de NCCs tronco foram identificados 9.
Convencional em abordagens in vitro para estudar o comportamento quimiotática de células aderentes trabalhar melhor com imortalizados, homogénea células distribuídas, mas são mais difíceis de aplicar a certas culturas primárias de células-tronco que, inicialmente, não possuem uma distribuição homogênea e rapidamente diferenciar (como NCC). Uma abordagem para homogeneizar a distribuição dos CBCs tronco para quimiotaxia estudos é isolar NCCs tronco a partir de culturas de explantes primários NT, em seguida, levantar e replate-los a ser quase 100% confluentes. No entanto, esta abordagem de revestimento requer quantidades substanciais de tempo e esforço para explantar células suficientes, é duro, e distribui NCCs tronco de um modo diferente daquele que foi encontrado em condições in vivo.
Aqui, apresentamos uma abordagem in vitro que é capaz de avaliar quimiotaxia e outras respostas migratórios de tronco sem NCC requiringa distribuição celular homogênea. Esta técnica utiliza lapso de tempo de imagem de principal, imperturbável NCCs tronco dentro de uma câmara de Zigmond modificado (uma câmara Zigmond padrão é descrito em outra parte 10). Ao expor NCCs tronco na periferia da cultura a um gradiente chemotactant que é perpendicular à sua direccionalidade previu natural, alterações na polaridade migratório induzidas pelo gradiente chemotactant aplicada pode ser detectado. Esta técnica é pouco dispendioso, requer a cultura de apenas dois explantes por tratamento NT replicate, evita levantamento célula dura (tal como tripsinização), deixa NCCs tronco de uma distribuição mais semelhante a condições in vivo, reduz a quantidade de tempo entre o explante e experimentação (o que provavelmente reduz o risco de diferenciação), e permite a avaliação de lapso de tempo de numerosas características migratórias.
Protocol
Discussion
Realização de pesquisas sobre a quimiotaxia NCCs tronco provou um desafio para uma série de razões. NCCs tronco constituem uma população heterogénea de células estaminais que se diferenciam de cultura de longo prazo, por isso, NCCs tronco deve ser obtido a partir de explante primário do tronco NT-nível. Os métodos convencionais para estudar a resposta quimiotáctica de forma homogénea as populações de células in vitro são distribuídos difícil de testar em NCCs tronco desde que eles exigem que …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos graças especiais para Lino Kim, Steve Guzman e Satyarthi Ujit de assistência técnica durante o desenvolvimento deste método. Myron Hawthorne, Richard Spengel, e Roberto Rojas usinado as câmaras usadas aqui e desde muito necessária assistência técnica. Notavelmente, Roberto Rojas produzido Figura 4. Estamos também gratos conselhos inestimáveis Scott Fraser antes do desenvolvimento do ensaio de quimiotaxia acima. Este trabalho foi parcialmente financiado por um SCORE-5S06GM048680-13 NIH-MBRS para Medb e por um prêmio do, Northridge CSU de Pós-Graduação Programa de Apoio à Tese de CW.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Omega Scientific | DM-22 | |
| Penicillin Streptomycin Solution | Omega Scientific | PS-20 | 100X Stock Concentration |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 100X Stock Concentration |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Lot# 105247 (or another that is comparable) |
| Modified Zigmond chamber | Home made | N/A | Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol |
| Cell culture dish | Denville | T6040 | 40 x 10 mm |
| Fibronectin | BD | 354008 | 10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | Precleaned; 22 x 22 mm |
| L15 medium | Thermo Scientific | SH30525.02 | |
| Petroleum Jelly | Comforts | 011110794642 | 100% |
| Centrifuge tube | Biologix | 10-9152 | 15 ml |
| Dispase | Cell Systems | 4Z0-850 | 10X Stock Concentration |
| Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
| Needle | BD | 305127 | 25 G x 1.5 in. |
| Alexa Fluor 488-IgM | Invitrogen | A21042 | Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM |
| Dissecting Forceps | FST | Misc. | Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium |
| Tungsten Needle | N/A | N/A | Home made; placed in a pin holder |
| Blunt Forceps | Tiemann | 160-18 | Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk |
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:
- Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
- Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
- Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
- Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
- Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
- Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
- Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
- Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
- Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.
References
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Baker, C. V. . Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).
- Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. Division of labor during trunk neural crest development. Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).
- Wang, H. U., Anderson, D. J. Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth. Neuron. 18, 383-396 (1997).
- Krull, C. E. Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration. Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).
- Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).
- De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells. The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).
- Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells. J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chicken embryo. J. Morph. 88, 49-52 (1951).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Davis, E. M., Trinkaus, J. P. Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).
