تحليل العصبية كريست الهجرة جذع الخلية باستخدام التعديل الفحص غرفة زيجموند
Summary
يوصف هذا النهج لتحليل الهجرة من الخلايا explanted (خلايا الجذع قمة العصبية). هذه الطريقة غير مكلفة، لطيف، وقادرة على التمييز الكيميائي من كلا تنشيط كيميائي والتأثيرات الأخرى على الاستقطاب المهاجرة مثل تلك المشتقة من خلية خلية التفاعلات داخل الجذع العصبية الأولية قمة الثقافة الخلية.
Abstract
الخلايا العصبية قمة (البلدان المساهمة الصافية) هي عابرة السكان من الخلايا موجودة في الفقاريات التي التنمية الهجرة من الأنبوب العصبي الظهري (NT) بعد خضوعه ل1،2 الانتقال الظهارية-الوسيطة. بعد EMT، البلدان المساهمة الصافية الهجرة مسافات كبيرة على طول مسارات النمطية حتى وصولها الى اهدافها. البلدان المساهمة الصافية تفرق في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية، الخلايا الصباغية، والخلايا أليفة الكروم 1-3. قدرة البلدان المساهمة الصافية لتصل إلى مواقعها والتعرف على الهدف الصحيح هو التأسيسية لتشكيل المناسب لجميع الهياكل التي تحتوي على الجذع NCC المستمدة من المكونات 3. توضيح آليات التوجيه لجذع NCC الهجرة كان ذلك مسألة ذات أهمية كبيرة. وقد أظهرت العديد من الجزيئات لتوجيه NCC الهجرة 4. على سبيل المثال، من المعروف أن البلدان المساهمة الصافية الجذع صده العظة التوجيه السلبية مثل Semaphorin، Ephrin، والشق يغاندس 5-8. ومع ذلك، لاحتى مؤخرا أي من البلدان المساهمة الصافية chemoattractants الجذع تم تحديد 9.
التقليدية في النهج المختبر لدراسة السلوك الكيميائي للخلايا ملتصقة تعمل بشكل أفضل مع الخلايا متجانس خلد، توزيع، ولكنها أكثر صعوبة لتطبيق بعض الثقافات الخلايا الجذعية الأولية التي تفتقر في البداية توزيع متجانس وتفرق بسرعة (مثل البلدان المساهمة الصافية). نهج واحد لتحقيق التجانس توزيع البلدان المساهمة الصافية للدراسات الجذع الكيميائي هو عزل البلدان المساهمة الصافية الجذع من المرحلة الابتدائية الثقافات يزدرع NT، ثم ارفع وreplate لها أن تكون ما يقرب من 100٪ متموجة. ومع ذلك، فإن هذا النهج يتطلب الطلاء كميات كبيرة من الوقت والجهد ليزدرع الخلايا بما فيه الكفاية، قاس، وتوزيع البلدان المساهمة الصافية الجذع بطريقة تختلف عن تلك الموجودة في الجسم الحي في ظروف.
هنا، ونحن التقرير نهجا في المختبر قادر على تقييم ردود المهاجرة الكيميائي وغيرها من البلدان المساهمة الصافية دون الجذع requirinالجا متجانسة التوزيع الخلية. هذه التقنية تستخدم الوقت الفاصل بين التصوير الأولية، رابط الجأش البلدان المساهمة الصافية الجذع داخل غرفة زيجموند المعدلة (يوصف غرفة زيجموند القياسية في أماكن أخرى 10). من خلال تعريض البلدان المساهمة الصافية في محيط الجذع من الثقافة إلى أن الانحدار chemotactant هو عمودي على اتجاهها الطبيعي توقع، يمكن الكشف عن تغييرات في الاستقطاب الناجم عن الهجرة التدرج chemotactant التطبيقية. هذه التقنية غير مكلفة، تتطلب زراعة من إإكسبلنتس NT اثنين فقط في علاج تكرار، يتجنب قاسية رفع الخلية (مثل trypsinization)، ويترك البلدان المساهمة الصافية في الجذع توزيع أكثر مماثلة لفي ظروف الجسم الحي، التخفيضات مقدار الوقت بين explantation والتجريب (مما يقلل من خطر المحتمل تمايز)، ويسمح الوقت الفاصل بين تقييم الخصائص المهاجرة عديدة.
Protocol
Discussion
إجراء البحوث الكيميائي على البلدان المساهمة الصافية الجذع وقد ثبت تحديا لسلسلة من الأسباب. البلدان المساهمة الصافية الجذع تشكل الخلايا الجذعية غير المتجانسة التي من شأنها أن تفرق السكان إذا مثقف على المدى الطويل، وبالتالي، يجب الحصول على الجذع من البلدان المساهمة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نقدم الشكر الخاص لكيم لينو، وستيف جوزمان ساتيارثي Ujit للمساعدة التقنية خلال تطوير هذا الأسلوب. تشكيله مايرون هوثورن، Spengel ريتشارد، وروبرتو روخاس الدوائر المستخدمة هنا وقدمت الكثير في أمس الحاجة إليها المساعدة التقنية. والجدير بالذكر أن إنتاج روبرتو روخاس الشكل 4. كما نشكر للمشورة سكوت فريزر لا تقدر بثمن قبل وضع الفحص الكيميائي من أعلاه. وأيد هذا العمل من قبل جزئيا على درجة 5S06GM048680-13-NIH-MBRS لMEdB وجائزة من، CSU برنامج الدراسات العليا نورثريدج دعم الرسالة إلى CW.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM | Omega Scientific | DM-22 | |
| Penicillin Streptomycin Solution | Omega Scientific | PS-20 | 100X Stock Concentration |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 100X Stock Concentration |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Lot# 105247 (or another that is comparable) |
| Modified Zigmond chamber | Home made | N/A | Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol |
| Cell culture dish | Denville | T6040 | 40 x 10 mm |
| Fibronectin | BD | 354008 | 10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | Precleaned; 22 x 22 mm |
| L15 medium | Thermo Scientific | SH30525.02 | |
| Petroleum Jelly | Comforts | 011110794642 | 100% |
| Centrifuge tube | Biologix | 10-9152 | 15 ml |
| Dispase | Cell Systems | 4Z0-850 | 10X Stock Concentration |
| Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
| Needle | BD | 305127 | 25 G x 1.5 in. |
| Alexa Fluor 488-IgM | Invitrogen | A21042 | Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM |
| Dissecting Forceps | FST | Misc. | Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium |
| Tungsten Needle | N/A | N/A | Home made; placed in a pin holder |
| Blunt Forceps | Tiemann | 160-18 | Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk |
Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber
Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:
- Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
- Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
- Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
- Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
- Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
- Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
- Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
- Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
- Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.
References
- Le Douarin, N. M. The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story. Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).
- Baker, C. V. . Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).
- Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. Division of labor during trunk neural crest development. Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).
- Wang, H. U., Anderson, D. J. Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth. Neuron. 18, 383-396 (1997).
- Krull, C. E. Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration. Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).
- Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).
- De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells. The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).
- Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells. J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chicken embryo. J. Morph. 88, 49-52 (1951).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Davis, E. M., Trinkaus, J. P. Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).
