Ice-Cap: Büyüyen Bir Yöntem Arabidopsis
Summary
Ice-Cap yöntemi bir 96-kuyucuğu ve her fide olmayan yıkıcı hasat kök doku bitkilerin büyümesine izin verir. Bu kök dokusu elde edilen DNA genotipleme reaksiyonlar için kullanılabilir. Ice-Cap iyi çalıştığını bulduk<em> Arabidopsis thaliana</em>, Domates, pirinç fideleri.
Abstract
Bu bitkilerin çok sayıda genotipleme gerektiren projeler geliştirmek için bitki bilim adamları için yaygın hale gelmektedir. Herhangi bir genotipleme projesinde ilk adım, her bir bitkinin bir doku örneği toplamak için. Bu görevi geleneksel yaklaşım örnek bitkiler için bir-at-a-zaman. Ancak, bir dilek bireylerin genotip yüzlerce ya da binlerce genotipleme boru hattının önemli bir darboğaz bu strateji sonuç kullanıyorsanız. Biz burada açıklamak Ice-Cap yöntemi, bir bilim adamı, tek bir günde 1,2 birkaç bin fide doku toplamak için izin vererek bu zorluğu yüksek verimli bir çözüm sağlar. Bu verim düzeyi, doku, bitki yerine bir-at-a-çok 96-at-a-zaman hasat olduğu gerçeği ile mümkün hale gelmiştir.
Ice-Cap yöntem fide büyüme, doku hasat ve DNA ekstraksiyon gerçekleştirmek için entegre bir platform sağlar. Ice-Cap temelinde seedli büyüme96-kuyucuğu yığılmış çifti NGS. Üst plaka kuyu bireysel fide çimlenmeye agar büyüme medya fişleri içerir. Agar medya aracılığıyla üst plaka, bir delikten çıkmak ve daha düşük bir plaka içeren su geçer kökleri aşağı doğru büyür. Üst plaka fide oda sıcaklığında devam ederken, DNA ekstraksiyon, kök doku içeren alt tablası su doku hasat için hızla dondurulur. Üst plaka, 96 kök doku örneklerinde buz ve 96 canlı fideler ile bir tabak içinde donmuş bir tabak verimli alt tabak soyulmuş. Bu teknik, kök doku yakalamak için buz kullandığı için "Ice-Cap" olarak adlandırılmıştır. Fide içeren 96 plaka daha sonra folyo ile sarılmış ve düşük sıcaklık transfer. Bu işlem fideler daha fazla büyüme askıya ama onların canlılığı etkilemez. Genotip analizi tamamlandıktan sonra, istenilen genotipi ile fideler 96-iyi p transfer edilebilirdaha fazla yayılması için toprağa geç. Biz, Arabidopsis thaliana, domates, pirinç ve fide kullanarak Ice-Cap yöntemi yararını göstermiştir . Biz yöntem 96-kuyucuğu kuyu içine sığacak kadar küçük tohumlar bitkilerin diğer türler için de geçerli olması gerektiğini bekliyoruz.
Protocol
1. Ice-Cap Fide Tabaklar Agar Büyüme Medya ile hazırlayın Erimiş büyüme ortamı (0.5x Murashige ve Skoog (MS), bazal tuz karışımı, 2 mM Morpholinoethanesulfonic asit (MES),% 0.6 agar (w / v), pH 5.7) MicroFill Mikroplaka Dispenseri kullanarak otoklavlanmış Fide Tabaklar içine sürülür. Bir litre medya 18 Fide Tabaklar başına ihtiyaç vardır. Vidalı üst kapakları ve 20 dakika otoklav ile bir litrelik cam şişelerde büyüme ortamı hazırlayın. Otoklav bir litre distile su vidalı kapak ile cam şişe. Aynı zamanda da alüminyum folyo ile sarılmış boş Fide Tabaklar otoklavda. 65 yaşında bir kuluçka ayarlamak için otoklava medya ve su transferi ° C Bu sıcaklık, erimiş bir devlet büyüme ortamı devam edecektir. Otoklav sonrası, folyo ve kuru laminer akış kaput yer Fide Tabaklar çıkarın. Tabaklar, yapışkanlı bant, böylece geçmeden önce tamamen kuru olmalıdırtamamen plakaların kuyuların alt delik mühür. % 95 etanol ile sterilize etmek için bench aşağı doğru silin. Sterilize etmek için,% 95 etanol Fide Tabaklar için şeffaf plastik kapaklar bekletin. Laminer akış kaput etanol ve kuru hava kapaklarını çıkarın. Otoklav eriyecek, çünkü plastik kapaklar sterilize etmek için otoklava sokmayın. Ambalaj bandını her Fide Plaka altına uygulayın ve sıkıca rulo aracını kullanarak mühür. 65 ° C'de su banyosu içinde erimiş büyüme ortamı ve steril suyun şişe yerleştirin. MicroFill makineye oda sıcaklığında% 70 etanol içeren bir şişe takın ve tasfiye döngüsü MicroFill makine tesisat sterilize etmek için iki kez çalıştırmak. MicroFill makine steril su ile şişe takın. Sıhhi tesisat sıcak ve etanol sistemi temizlemek için temizleme çevrimi altı kez çalıştırın. Bu işlem boyunca şişe su 65 ° C banyo kalmalıdır. Steril su ile temizler tamamladıktan sonra, hemen MicroFill makine erimiş büyüme medya şişe takın. Tasfiye döngüsü distile su tesisat temizlemek için iki kez çalıştırın. Bu işlem boyunca 65 ° C banyo şişe büyüme medya kalmalıdır. 450 mikrolitre büyüme medya her Fide Plaka kuyuların içine koyun. Hızla büyüme medya MicroFill makine tesisat katılaşarak olmadığını çalışın. Fide Tabaklar dolu olduğunda, hemen MicroFill makinenin şişe 65 ° C steril su ekleyin ve temizleme çevrimi sıhhi tesisat temizlemek için 12 kez çalıştırmak. Bu işlem boyunca 65 ° C banyo şişe su kalmalıdır. Bir MicroFill makine mevcut değilse, Fide Tabaklar da el-kanallı pipet kullanarak mühürlü plakaların içine erimiş agar pipetleme tarafından hazırlanmış olabilir. Her Fide Tabaklar t kuyu kontrol edino büyüme ortamı herhangi bir kuyu dışarı sızdırılmış olmadığından emin olun. Bireysel kuyulara El pipet ek erimiş büyüme ortamı gerektiği gibi. Şeffaf plastik bir kapak ile her levha Kapak ve büyüme ortamı oda sıcaklığında Fide Tabaklar katılaşmasını sağlamak. Yığın plakaları ve depolama için alüminyum folyo ile sarın 4 ° C Mağaza plakaları ters depolama sırasında kuyulardan su birikmesini önlemek için. 2. Ice-Cap Fide Tabaklar ve çimlenmeye Fideleri içine Sow Tohumları Daha önce bir tohum yükleme cihazı (2) Fide Tabaklar Arabidopsis tohum dağıtımı için yarı otomatik bir yöntem tanımlanmıştır. Bu cihaz, tohum bazı partiler için yararlı olsa da, biz Arabidopsis tohumu farklı partiler tarafından gösterilen tohum boyutu değişkenlik Bu cihazın genel kullanımını sınırlar bulduk . Biz bu tohum dağıtımı için bir alternatif otomatik bir yöntem geliştirme sürecindeŞu anda biz Fide Tabaklar içine tohum dağıtım için en etkili strateji, aşağıda açıklandığı gibi elle, bu adımı gerçekleştirmeniz olduğunu t bulduk. Whatman filtre kağıdı üzerine kuru tohumları serpin. % 95 etanol tüm tohumların etanol ile kaplıdır, böylece tohum üzerine koyun. Bu tedavi yüzeyi tohum sterilize edecektir. Tohumları kuru hava için izin ver. Değiştirilmiş bir tek cam Pasteur pipeti kullanarak Fide Tabaklar kuyulara bireysel tohumları aktarın. Pasteur pipet ucu yanan tarafından mühürlenir. Ortaya çıkan cam ucu tek bir tohum kolayca kaldırdı ve Fide Plaka kuyulardan agar yüzeyine transfer olmak için izin verir agar medya, hafifçe dokunarak ıslatılır. Bu tohum kaplama aracın çift başlı bir versiyonu da verimi artırmak için kullanılabilir. Her Fide Plaka şeffaf plastik kapak ve conta ile Micropore cerrahi bant ile kaplayın. Yığılmış plakaları sarınalüminyum folyo ve mağaza Arabidopsis tohumları ile 4 ° C dört gün için tohumların çimlenme tabakalandırmak ve senkronize etmek için. Domates tohumu dört gün boyunca, 12 ° C'de karanlıkta muhafaza edilmelidir. 18 ° – 20 ° C çimlenme başlatmak için floresan ışığı altında Fide Tabaklar yerleştirin. 3. Ice-Cap Çeşmesi Fide Tabaklar transfer Fide Plakalar ışık altında dört gün sonra, Ice-Cap çeşme Fide Tabaklar aktarın. Arabidopsis için, fide genellikle 10 ila 14 gün Ice Cap çeşme bırakılmıştır. Ice-Cap Çeşmesi bir plastik saklama kutusu içine yerleştirilmiş olan özel raf yapının üstüne bir tanımlama levha koyarak birleştirin. Tesviye fındık çerez levha seviyesini ayarlamak için kullanın. Bir dalgıç pompa saklama kutusu yerleştirin ve bir yaylı cla kullanarak çerez levha yan pompa çıkış hortumu eklemekmp. Ice-Cap Çeşmesi, Ice-Cap Çeşmesi yüzey direkt floresan aydınlatma alması için bitki büyüme odası ya da büyüme odasına bir raf üzerinde birleştirin. Ice-Cap Çeşmesi 3 parça 1 kısım musluk suyu distile su karışımı ile doldurun. Dalgıç pompa, su seviyesinin altında birkaç santimetre kadar çeşme su ilave edilmelidir. Laboratuvar bant kullanarak plastik saklama kutusu, son su seviyesi ve işaretleme kalemi işaretleyin. Kök Tabaklar Kök Plaka her iyi bir 3/32-inch çapında paslanmaz çelik bilya ekleyerek hazırlayın. Paslanmaz çelik bilyalar kullanılarak yapılan özel bir top dağıtma cihazı, 1 Kök Plaka eklenebilir . Bu cihaz 96-PCR plaka yüzey üzerine alüminyum folyo tek bir sayfaya yerleştirme ve folyo yüzey üzerinde her bir kuyunun merkezleri yerleri işaretlemek için bir işaretleme kalemi kullanarak yapılır. Bu işaretli levha folyo alüminyum ek bir 6 sayfa üstüne yerleştiriliril ve kullanılan pipet ucu kutusu kapağı ve pürüzsüz bir yüzeye sarılı. Böyle bir ahşap şiş gibi keskin bir aracı daha sonra 96 pozisyonların her biri tek bir metal topu tutmak için yeterince büyük bir çimen oluşturmak için kullanılır. Topları ile bu dağıtım cihazı doldurmak için, aşırı metal topları cihaz üzerinden dökülür ve aşırı topları kaldırmak için hafifçe çalkalanır. Kök Plaka sonra topu Kök Plate her kuyuya bir damla devrildiğinde dağıtım cihazı, üst üzerine yerleştirilir. Kök Plaka MicroFill makine kullanarak her bir kuyunun 340 mikrolitre 3 parça 1 kısım musluk suyu distile su karışımı ekleyin. Çelik bilyalar, su dağıtım önce Kök Plaka eklenmiş olduğunu emin olun. Fide Tabaklar altındaki kapalı yapışkan film soyun ve plakalar şeffaf plastik kapakları kaldırmak. Kök Plaka metal bir top ve su içeren her Fide Plaka yerleştirin ve iki elastik hai ile birlikte iki tabak güvenlir bantları. Ice-Cap Çeşmesi yığılmış Ice-Cap tabak yerleştirin. Plakalar Ice-Cap Çeşmesi zaman açık plastik kapaklar kullanılmamalıdır. Fide Plate A-01 Kök Plaka A-01 ile uyumlu olduğundan emin olmak için kontrol edin. Fide çoğunluğu Kök Tabaklar nüfuz kök doku kadar yığılmış Fide / Kök Tabaklar Ice-Cap Çeşmesi bırakılmalıdır. Ice-Cap Çeşmesi Arabidopsis fide için ideal gelişme sıcaklığı yaklaşık. 18 ° C Çerez levha su seviyesi Fide Plate fide batık olduğunu öyle derin, öyle ki su Kök Tabaklar kuyu içine akabilir, ama olmamalıdır. Su seviyesi doğru değilse doğru derinlik farklı bir çerez levha almak gerekir. Ice-Cap Çeşmesi, orijinal su seviyesini korumak için periyodik olarak damıtılmış su ekleyin. Çeşme saf distile su ekleyerek yerini alacakçeşme suyu mineral bileşimi değiştirmeden sıvı buharlaşması nedeniyle kaybetti. Ice-Cap Çeşmesi Su seviyesi günlük olarak kontrol edilmelidir. 4. Hasat Kök dokusu Kök dokusu kök Plate suyun donma ve ardından Kök Plaka uzak Fide Plaka soyma hasat edilir. Gün kök doku hasat öncesi, Ice-Cap Çeşmesi'nden yığılmış Ice-Cap Tabaklar çıkarın. Yığılmış Fide ve Kök plakalar kuyuları arasında üç ahşap şiş takın. Şiş amacı, dondurma işlemi için hazırlık Kök plakalar kuyulardan Fide Tabaklar hazretleri yükseltmektir. Gece ışıkları altında durmak eklenen tahta şiş ile yığılmış Ice-Cap Tabaklar izin verin. Bu kuluçka sonraki dondurma ve plaka ayırma işlemleri kolaylaştıran Kök Tabaklar, sıvı hafif buharlaşma sağlar. Üzerindedoku hasat gün, donmuş bir banyo hazırlayın. 96-iyi bir metal termal blok kuru buz ve% 95 etanol karışımı ile kabına yerleştirin. Termal blok ca sıcaklık dengelenmesi için izin ver. 20 dakika. Pyrex çanak yalıtım malzemesi gibi düşük sıcaklık laboratuar tezgah yüzeyine zarar vermez, böylece mitten bir otoklav gibi bazı tip üstüne yerleştirin. 5 dakika soğutulmuş termal blok ve inkübe içine tahta şiş ile yığılmış Ice-Cap tabak yerleştirin. Kök Plate Bu süre boyunca katı su donar. Fide Plate fide, bu tedavi sırasında dondurmak ve tam canlı kalmaz. Termal blok yığılmış Ice-Cap plakaları çıkartın ve oda sıcaklığında bench üzerine koyun. Lastikleri ve yığılmış plakalar ahşap şiş çıkarın. Fide Plaka üst plakalar "crack" için sıkıca bastırın. Kök Plaka ve Fide Plaka ap soyma sonra dikkatlicesanat. Kök Tabaklar su oda sıcaklığında çözünme izin verin. Çözülme 25 termal blok ° C Kök Tabaklar kuluçka hızlandırılmış 5. Mağaza Fide Plate in the Dark Düşük Sıcaklık Doku hasat sonrasında fide plakaları genotip analizi yapıldığında ise fide canlılığını koruyacaktır düşük ısıda karanlıkta saklanabilir. Fide canlılığı etkileyen birkaç hafta boyunca bu sıcaklıklarda saklanabilir. Fide plakanın alt kısmında mühür, yapışkan bant ile doku hasat sonrasında. Fide Plaka üstüne şeffaf plastik kapak yerleştirin ve mikropor bant ile sabitleyin. Birlikte çeşitli Fide Tabaklar Yığın ve alüminyum folyo ile sarın. Arabidopsis fide, 4 tabak ° C Domates fideleri için, 12 ° C'de plakaları Bir kez genotipleme se, tamedlings bu düşük sıcaklık kuluçka kaldırılır ve aşağıda açıklandığı gibi toprak nakledilen olabilir. 6. DNA Ayırma PCR reaksiyonları için uygun DNA, kök doku örnekleri kolayca elde edilebilir. Arabidopsis kök doku örnekleri ele toplam DNA verim ca. Ortalama 2 400 ng. Kök Tabaklar su DNA ekstraksiyon işlemi gerçekleştirmeden önce tamamen çözülmüş olduğundan emin olun. Herhangi bir kuyu ortalamaya göre önemli ölçüde daha az su olup olmadığını belirlemek için tabak olmadığını kontrol edin. El pipet distile ilave su gerektiren kuyu içine su. Kök Plakalar her bir kuyunun 25 mikrolitre; Tris-EDTA solüsyonu (50 mM EDTA, pH8 500 mM Tris, pH 8) eklemek için MicroFill makinesi kullanın. Kök plakalar termal sızdırmazlık folyo ve ısı yapıştırma makinesi kullanarak kuyu Seal. GenoGrinder makine mühürlü kök tabak yerleştirin.aşağı bakacak şekilde plakalar mühürlü sonuna. Bu plaka yönünü, en iyi boncuk hareketi sağlar ve boncuk kuyularda yapışmasını önler. Dakikada 1350 vuruş GenoGrinder plakalar 3 ½ dakika sallayın. Mikroplak taşıyıcıları ile bir santrifüj plakaları transferi ve 3500 RPM hızında 10 dakika boyunca plakalar döndürmek 4 ° C pelet için pulverize kök doku. Sonucunda seyreltilmiş özü doğrudan PCR reaksiyonlarında kullanılabilir genomik DNA içerir. Tipik bir PCR reaksiyonu bu DNA özü 2 mikrolitre katacak. DNA örnekleri depolama için mikroplak mührü yapışkanlı bant ve yer eksi 20 ° C DNA örnekleri kalitesinde belirgin bir azalma ile birkaç ay boyunca saklanabilir. 7. Toprak için İstenilen Genotip ile Fideleri aktarın Genotip analizi tamamlandıktan sonra, istenilen genotipi ile fideler Fide transfer edilebilirToprağa Tabaklar. Fide Plakalar soğuk depolama çıkarın ve suya doymuş toprak karışımı ile tencere hazırlamak. Fide Plaka ayrı bir fide çıkarmak için, bir fide zarar vermeden agar fişi kapmak için olanak sağlayan bir forseps kullanın. Forseps ile agar fişi fide zarar vermemek için dikkatli olmak Fide Plaka agar fiş alın ve yavaşça kaydırın. Alternatif olarak, basınçlı hava agar tak ve hafifçe dışarı fide iyi çekmek için kullanılabilir. Fiş bench üzerine dışarı çıkar kadar kuyunun altındaki küçük delikten basınç uygulayın. Toprak agar fişi boyutu küçük bir delik hazırlayın. Toprak agar fiş yerleştirin ve toprak fide güvenliğini sağlamak için agar fişi etrafında nemli toprak paketi. Herhangi bir fide her yerinden agar kaldırmak için teşebbüs etmeyin. Standart büyüme koşulları altında bir büyüme odasında nakledilen fide yerleştirin. Için plastik bir kapak ile tencerenin kapağını kapatın.İlk iki gün sonra nakli. Daha sonra kapağını kaldırın ve bitkilerin standart koşullar kullanarak büyümeye devam ediyor. 8. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 4A, Ice-Cap sistemi kullanılarak yetiştirilen Arabidopsis fidelerinin bir örnek gösterilmiştir . Bu fide resmi alındığında, iki hafta boyunca, Ice-Cap çeşme ve doku hasat için hazır olduklarını vardı. Bu aynı fide kök doku Şekil 4B gösterilmiştir. Arabidopsis kök dokusunun bir örnek çıkarılan DNA toplam tutarı 100 ng 700 ng 2 aralığında genellikle. Bu verim hesaplama sadece bir kısmını ham kök ekstresinin kullanımına dayanmaktadır. Bu ca sadece. Ham kök ekstresi% 10 genellikle DNA ekstraksiyon işlemi için kullanılan, ham özü koruyarak, sonraki analiz için önemli ölçüde daha genomik DNA elde etmek mümkündür. Kullanılarak elde edilen genomik DNA toplam tutarı Ice-Kap prosedür PCR reaksiyonları 2 yüzlerce gerçekleştirmek için yeterli. Şekil 1: Ice-Cap sürecinin akış şeması. A) fide çimlenmeye agar büyüme ortamı içeren Fide Plate. Kökler agar nüfuz ve plakasının altına doğru büyüyebilir. Plaka kuyu diplerinde delikler yapışkan film ile mühürlenir. B) Fide Plaka Kök Plaka su içeren ve metal bir topu üst üste. Kökler Fide Plaka kuyu diplerinde delikleri çıkmak ve Kök Plaka kuyu içine büyümek. Yığılmış Ice kap tabak kuru buz / etanol banyo termoblok yerleştirilir önce C) Ahşap şiş gün Fide Plaka ve Kök Plate arasında eklenir. Kök Plate su donup sonra D), 96 doku örnekleri ile Kök Plaka Fide Plaka verimli, Kök Plaka soyulmuş.96 canlı fide ve Fide Plaka. Ahşap şişleri bu adımı sırasında iki tabak ayrılmasını kolaylaştırmak. Şekil 2: Fide Plaka ve Kök Plaka Fotoğrafları. A) Fide Plaka ve ayrı ayrı görülen Kök Plate. B) Fide Plaka Kök Plaka üstüne yığılmış. DNA ekstraksiyonu için kullanılan çelik bilya Kök Plaka kuyuları görülebilir. Elastik bantlar iki plaka birlikte güvence altına almak için kullanılır. Şekil 3: Ice-Cap Çeşmesi Ice-Cap Çeşmesi Kök Tabaklar kuyuların üstleri kesin yükseklikte sabit bir su seviyesini korumak için kullanılır. Bu sürekli sulama sistemi kök plakaların kuyulardan su buharlaşma ve terleme nedeniyle tükenmiş haline gelmemesi sağlar. A) bir ev yapılmış raf.yığılmış Ice-Cap Tabaklar oturduğu çerez levha destekler. B) çeşme yüzeyi boyunca düzgün bir su derinliği elde edilir, böylece tam çerez levha düzeyini ayarlamak için bir araç sağlar 1 "fındık birinin yakın çekim görüntüsü. C) Bu resim tüm görüntüler parçalar Ice-Cap Çeşmesi D) monte Ice-Cap Çeşmesi ev yapımı raf oluşturmak için gerekli bir dalgıç fıskiye pompası sürekli ev yapımı dayanmaktadır çerez levha, alt rezervuar su hareket raf. yaylı kelepçe hortum çerez levha kenarına takmak için kullanılır. Şekil 4: Ice-Cap süreci Arabidopsis fide kullanılarak yetiştirilir. A) Üstten görünüm bir Fide Plaka iki kuyu içine aşağı bakıyor. Her iyi bir Arabidopsis fide içerir. B) Kök Plate iki kuyu Yandan görünüm. Kökler büküm görülebileceğikuyuların iç yüzeyi etrafında. Bu resimde fide ca Ice-Cap Çeşmesi olmuştu. iki hafta ve doku hasat normal olurdu büyüme aşamasında.
Discussion
Burada sunulan Ice-Cap yöntemi, tek bir gün içinde bireysel bitkilerin bile yüzlerce ya da binlerce, doku örnekleri toplamak ve verimli bir şekilde kullanmak genotipleme reaksiyonlar için bu örnekleri genomik DNA ayıklamak için, bir bilim adamının sağlar. Bireysel bir bilim adamı, kısa bir süre içinde binlerce fide genotipi yeteneği vererek, Ice-Cap yöntemi, aksi takdirde gerçekleştirmek için pratik olmazdı bir dizi genetik deneyler kolaylaştırmak için bir potansiyele sahiptir. Bazı örnekler aşağıda verilmiştir.
- Genetik Haritalama. Güzel ölçekli genetik haritalama araştırmacı 3 kromozom boyunca belirli bir aralık içinde rekombinasyon olayları tanımlamak için ise hızlandırılmış olabilir. Bu aralığı çok kısa bir genetik mesafe gerektiriyorsa, o zaman rekombinasyon olayları ayırma haritalama nüfus nispeten nadir olacaktır. Bu nedenle, istenilen yeniden bulmak için bireysel bitkiler ekran binlerce için gerekli olabilircombinant bireyler. Bu süreç büyük ölçüde Ice-Cap kullanımı ile hızlandırılmış olabilir. Genom yeniden sıralama çağında bile, doğrudan belirli bir mutasyon bir ilgi fenotipi doğrudan sorumlu olduğunu göstermek için hala gereklidir. Bu durumlarda, aday mutasyon aslında etken olduğunu kanıtlamak amacıyla yakından bağlantılı diğer mutasyonlar uzak ilgi mutasyon ayırmak için gerekli olacaktır. Bu gibi durumlarda, Ice-Cap sıkıca bağlı mutasyonlar arasında bir çift bağ kırılması için etkili bir yöntem sağlayacaktır.
- Multi-mutantlar. Arabidopsis okuyan araştırmacılar için fonksiyonel fazlalık 4-6 aşmak için tek bir bireyin içine birkaç farklı lokusların mutant allel birleştirmek için yaygın hale gelmiştir. Bir örnek olarak, bir genetik geçişi ile tek bir bitki dört farklı lokusların mutant allel birleştirmek isteyen bir durumda düşünün. Bu proje için, üretmek için gerekli olacaktırgeçiş şemasının bir parçası olarak bu dört lokusların heterozigot birey. Bu dörtlü heterozigot setleri tohum, dörtlü homozigot döl ortaya çıkan nüfus 256 kişiden birinin bir oranda mevcut olması bekleniyor. Geleneksel yöntemler ile bu nadir bir birey için Eleme oldukça emek yoğun olurdu. Karşılaştırıldığında, Ice-Cap bu proje için kullanarak, tek bir nesil nadir dörtlü homozigot belirlenmesi için etkin bir strateji ile bilim adamı sağlayacaktır.
- iTILLING. Laboratuvarımız son zamanlarda yeni bir yaklaşım, genlerdeki Arabidopsis 7 faiz kaynaklı mutasyonların varlığı için tarama nitelendirdi. Bu yöntem, kimyasal bir mutajen 8-10 ile tedavi edilen bireylerin sipariş popülasyonlarda mutasyonlar bulmak için kullanılan bu toprağın işlenmesinde adında kurulmuş bir teknik bir çeşididir. Bir ind, toprağın işlenmesinde kişiselleştirilmiş bir versiyonu çünkü iTILLING yöntem adında varividual bilim adamı geleneksel olarak büyük bir araştırma ekibi tamamlamak için gerekli bir şey başarmak için. Ice-Cap, 7 iTILLING yöntemi aşağıda açıklandığı gibi ayrılmaz bir parçasıdır.
ITILLING arkasındaki fikir, geleneksel toprağın işlenmesinde projeler için oluşturulan dayanıklı mutant nüfusunun aksine duruyor geçici bir mutant nüfusu üretmektir. ITILLING için, 50 ila 100 Buz kap bloklar halinde bir Hacimli M2 nüfus tohumları ekilen ve DNA Ice-Cap yöntemi ile elde edilir. Arabidopsis fideler daha sonra yerleştirilen 4 ° C Ice-Cap DNA mutasyon tarama kullanılarak yapılır preparatlarıyla. Domates fideleri 12 ° C'de saklanır. Fide taşıyan istenilen mutasyonlar tespit edildikten sonra, Ice-Cap plakalardan kurtarıldı ve toprağa aktarılır. iTILLING ekrana, tüm bir araştırma toplum için uzun süreli bir mutant nüfus sağlamak için uygun değildir. ITILLING Bunun yerine, bir strateji sağlarBir bilim adamı, verimli ve nispeten düşük bir maliyetle, hızlı bir avuç gen mutasyonları için özel bir mutant nüfusunun ekranı yapabilirsiniz.
Ice-Cap Arabidopsis, domates, pirinç büyüyen ve genotipleme için etkili bir yöntem olarak buldular. Biz diğer bitki türleri de Ice-Cap uygun olması gerektiğini bekliyoruz. Bir sınırlama Ice-Cap kalınabilmektedir çeşitli türlerin tohumlarının boyutu. 96 plaka kuyuların içine sığacak kadar küçük tohumlar Sadece bitkiler bugünkü yapılandırma Ice-Cap ile uyumlu olacak.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (hibe sayısı MCB-0.447.750) bir hibe tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
| ABgene Thermo-Sealer | ABgene USA | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
| Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
| MicroFill Microplate Dispenser | BioTek www.biotek.com |
AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
| Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
| Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
| 33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet |
| 30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
| Hose for fountain pump | Any lab supply company | Hose compatible with fountain pump | |
| Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
| Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Falcon www.bdbiosciences.com |
351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| 3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
| 3 inch Elastic hair bands | Local grocery store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
| 4 mm diameter wooden skewers | Local grocery store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
| Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
| Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
| Agar – cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
| Easy Peel heat sealing foil | ABgene USA | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
| Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd | OfficeMax www.officemax.com |
Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
| Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
| 96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
| Whatman Filter paper | Whatman International | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
| Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. |
References
- Clark, K. A., Krysan, P. J. Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0). Plant Methods. 3, 8-8 (2007).
- Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis. Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).
- Jander, G. Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).
- Liljegren, S. J. SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis. Nature. 404, 766-770 (2000).
- Buechel, S. Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration. Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).
- Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis. Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery. Plant J. 45, 684-694 (2006).
- Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).
Cite This Article
Su, S., Clark, K. A., Gibbs, N. M., Bush, S. M., Krysan, P. J. Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping. J. Vis. Exp. (57), e3280, doi:10.3791/3280 (2011).