Ice-Кап: метод выращивания Arabidopsis И томатов в 96-луночных планшетах для высокопроизводительного генотипирования
Summary
Ice-Cap метод позволяет выращивать растения в 96-луночных планшетах и непагубно урожая корневой ткани друг от рассады. ДНК, извлеченной из этого корня ткани могут быть использованы для генотипирования реакций. Мы обнаружили, что ледяная шапка хорошо работает для<em> Arabidopsis thaliana</em>, Томаты, и рассаду риса.
Abstract
Это становится общей для завода ученым разработать проекты, которые требуют генотипирование большого числа растений. Первым шагом в любом генотипирования проекта является сбор образца ткани из каждого отдельного растения. Традиционный подход к этой задаче является образцом растения одну за один раз. Если кто-то хочет генотип сотни или тысячи людей, однако, использование этой стратегии приводит к значительному узким местом в генотипирования трубопровода. Ice-Cap метод, который мы описываем здесь обеспечивает высокую пропускную способность решение этой проблемы, позволяя одному ученому собрать ткани от нескольких тысяч саженцев в одном 1,2 дня. Этот уровень пропускной способности стало возможным благодаря тому, что ткань собирают из растений, 96-в-времени, а не один-на-времени.
Ice-Cap метод обеспечивает интегрированную платформу для выполнения рост проростков, ткани урожая, и выделения ДНК. Основой для Ice-Cap является рост seedliNGS в стек пару 96-луночных планшетах. Скважинах верхней пластины содержат разъемы агар питательной среды, на которой отдельные саженцы прорастают. Корни растут вниз через агар СМИ, выход верхней пластины через отверстие, и пройдите в нижнюю пластину, содержащую воду. Для уборки ткани для выделения ДНК, вода в нижней пластины, содержащей корневой ткани быстро замороженных в то время как сеянцы в верхней пластины остаются при комнатной температуре. Верхняя пластина затем очищенные от нижней плиты, уступив одну пластину с 96 корневых образцы тканей замороженной во льду и одну пластину с 96 жизнеспособных сеянцев. Техника под названием "Ice-Кап", поскольку он использует лед, чтобы захватить корневой ткани. 96-луночного планшета содержащие саженцев может, завернутые в фольгу и переданы низкой температуре. Этот процесс приостанавливает дальнейший рост рассады, но не влияет на их жизнеспособность. После анализа генотипа была завершена, саженцы с желаемым генотипом могут быть перенесены из 96-и рпоздно, чтобы почва для дальнейшего размножения. Мы продемонстрировали полезность Ice-Cap метод с использованием Arabidopsis thaliana, помидор и риса саженцы. Мы ожидаем, что метод должен быть применим и к другим видам растений с семенами достаточно небольшим по размеру в лунки 96-луночных планшетах.
Protocol
1. Подготовка Ice-Cap Плиты Саженец с медиа-агар роста Расплавленный питательной среды (0,5 Мурасиге и Скуга (MS) базальной смесью соли, 2 мМ Morpholinoethanesulfonic кислоты (MES), 0,6% агар (вес / объем), рН 5,7) разливают в автоклаве Плиты Саженец использованием Диспенсер MicroFill микропланшетов. Один литр СМИ необходимы в 18 Плиты рассады. Подготовка питательной среды в одном литре стеклянных бутылок с винтовой пробкой и автоклаве в течение 20 минут. Автоклав одним литром дистиллированной воды в стеклянную бутылку с винтовой крышкой. В то же время также автоклаве пустые тарелки рассады, завернутые в алюминиевую фольгу. Передача автоклавного СМИ и воду, чтобы термостат при температуре 65 ° C. Эта температура будет поддерживать рост средств массовой информации в расплавленном состоянии. После автоклавирования удалить Саженец Плиты из фольги и поместить в поток ламинарным укрытием для просушки. Плиты должны быть полностью высушены прежде чем продолжить, чтобы клейкая лента упаковка можетполностью уплотнения отверстия в нижней части скважины пластин. Протрите лабораторном столе с 95% этилового спирта для дезинфекции. Замочите прозрачного пластика крышки для рассады пластин в 95% этанола для дезинфекции. Удалить крышками из этанола и сухой воздух в ламинарным укрытием потока. Не автоклаве пластиковыми крышками, чтобы стерилизовать их, потому что они расплавятся в автоклаве. Применение упаковочной ленты в нижней части каждой пластины рассады и твердо сальник с помощью ролика инструмент. Место бутылки расплавленной питательной среды и стерилизовать воду в ванну с водой установлена на уровне 65 ° C. Прикрепить флакон, содержащий 70% этанола при комнатной температуре до MicroFill машины и запустить цикл чистки два раза, чтобы санировать сантехника из MicroFill машины. Прикрепите бутылку стерильной водой для MicroFill машины. Выполните чистку цикла шесть раз, чтобы теплый и ясный сантехника этанола из системы. Бутылку воды должна оставаться в ванне 65 ° С на протяжении всего этого процедуры. После завершения чистки стерильной водой, сразу же приложите бутылку расплавленной питательной среды для MicroFill машины. Выполните чистку цикл в два раза, чтобы очистить дистиллированной воды из водопровода. Бутылка питательной среды должны оставаться в ванне 65 ° С на протяжении всего этого процедуры. Внесите 450 мкл питательной среды в лунки каждый саженец плиты. Работают быстро, так что рост СМИ не затвердеть в водопровод из MicroFill машины. Когда все Саженец Плиты были заполнены, сразу же приложите бутылку 65 ° C стерильной воды для MicroFill машины и запустить чистку цикл 12 раз для очистки сантехники. Бутылку воды должна оставаться в ванне 65 ° С на протяжении всего этого процедуры. Если MicroFill машину недоступен, Сеянец Плиты могут быть также получены путем ручного пипетирования расплавленного агара в запечатанном пластин помощью многоканальной пипетки. Осмотрите скважин каждого т рассады Плиты• Обеспечить, чтобы рост СМИ не просочилась из любой скважины. Рука пипетки дополнительные расплавленной питательной среды в отдельных скважин по мере необходимости. Обложка каждой пластинки с прозрачной пластиковой крышкой, и позволить СМИ, чтобы укрепить в Саженец пластины при комнатной температуре. Стек пластин и завернуть в алюминиевую фольгу для хранения при 4 ° C. Магазин пластины с ног на голову, чтобы предотвратить накопление воды в скважинах в процессе хранения. 2. Сейте семена в Ice-Cap Саженец Плиты и прорастать рассада Ранее нами было описано полуавтоматические метод для дозирования Arabidopsis семян в Саженец пластины с помощью устройства загрузки семян (2). Хотя это устройство может быть полезно для некоторых партиях семян, мы обнаружили, что изменчивость семян размер отображаемых различных партий семян Arabidopsis пределы общую полезность этого устройства. Мы находимся в процессе разработки альтернативных автоматизированный метод для семенного дозирования, бут в настоящее время мы обнаружили, что наиболее эффективной стратегией для дозирования семян в Саженец пластин для выполнения этого шага вручную, как описано ниже. Посыпать сухими семенами на ватмане фильтр. Внесите 95% этанола на семена, так что все семена покрыты этанола. Эта процедура стерилизации поверхности семян. Разрешить семена высохнуть на воздухе. Передача отдельных семена в лунки Саженец плит с использованием модифицированного одноразовой стеклянной пипетки Пастера. Конец пипетки Пастера запечатан пылающий наконечник. В результате стеклянным наконечником увлажняют, осторожно прикасаясь к агар массовой информации, что позволяет одному семена, чтобы быть легко взял и передал на поверхность агара в скважинах Саженец плиты. Двуглавого версию этого средства покрытия семян может быть также использована для увеличения пропускной способности. Обложка каждого Саженец Тарелка с прозрачной пластиковой крышкой и печать с микропоры хирургической лентой. Оберните сложенных пластинс алюминиевой фольгой и семена арабидопсиса хранить при температуре 4 ° C в течение четырех дней для стратификации семян и синхронизировать прорастания. Томатный семена следует хранить в темноте при 12 ° С в течение четырех дней. Место Саженец Плиты лампой дневного света на 18 ° до 20 ° С до начала прорастания. 3. Передача Саженец Пластины для Ice-Cap фонтан После Саженец Плиты были под легким в течение четырех дней, передача Саженец Пластины для Ice-Cap фонтан. Для Arabidopsis, саженцы, как правило, остается в фонтан ледяной покров от 10 до 14 дней. Соберите Ice-Cap фонтан, помещая лист печенья в верхней части стойки пользовательские структуры, который был размещен в пластиковый ящик для хранения. Используйте выравнивание гайки для регулировки уровня для выпечки. Место погружного насоса в ящик для хранения и прикрепить выход шланга от насоса в сторону лист печенья использованием пружинного CLAтр. Соберите Ice-Cap Фонтан на полке в комнате роста растений или ростовую камеру так, чтобы поверхность Ice-Cap фонтан получает прямого флуоресцентного освещения. Заполните Ice-Cap Фонтан со смесью из 3 частей дистиллированной воды на 1 часть водопроводной воды. Вода должна быть добавлена к фонтану до погружного насоса на несколько сантиметров ниже уровня воды. Марк окончательный уровень воды в пластиковой коробке хранения с использованием лаборатории ленту и маркером. Подготовка корневой пластины путем добавления одного 3/32-inch диаметра из нержавеющей стальной шарик в каждую лунку корневой пластины. Нержавеющих стальных шариков могут быть добавлены к корневой пластины использованием заказ мяч дозирования устройства 1. Это устройство выполнено путем размещения одном листе алюминиевой фольги на поверхность 96-луночного планшета ПЦР и с помощью маркера, чтобы отметить расположение центров каждой лунки на поверхности фольги. Это был лист фольги помещается в верхней части 6 дополнительных листов алюминия дляИра и обернуты вокруг гладкой поверхности крышки от использована коробка кончика пипетки. Острого инструмента, такие как деревянные вертел затем используется для создания дерн достаточно большой, чтобы провести один металлический шар в каждую из 96 позиций. Чтобы заполнить этот отпуск устройство с шариками, избыток металлических шариков поливают устройству и оно осторожно встряхивают, чтобы удалить лишнюю шаров. Корневая Пластина помещается на верхней части устройства дозирования, который перевернулся, чтобы поместить один мяч в каждую лунку корневой пластины. Добавить 340 мкл смеси из 3 частей дистиллированной воды на 1 часть водопроводной воды в каждую лунку корневой пластины использованием MicroFill машины. Убедитесь, что стальные шарики были добавлены к корневой пластины до дозирования воды. Пил клейкой пленки со дна Саженец Плиты и удалите прозрачную пластиковую крышку с пластинами. Место каждого Саженец пластины в корневой пластины, содержащей металлический шар и воды и безопасного две пластинки вместе с помощью двух упругих хаиГ полосы. Место сложены Ice-Cap пластин в Ice-Cap фонтана. Прозрачный пластик крышки не должно использоваться, когда пластины в Ледовом-Cap фонтана. Убедитесь в том, что хорошо-01, Сеянец пластина выравнивается с хорошо-01, корневой пластины. Сложены Саженец / Root Плиты должны быть оставлены в Ледовом-Cap фонтана, пока большинство саженцев имеют корень ткани, которая проникла в корневой пластины. Идеальная температура для роста арабидопсиса рассады в Ice-Cap Фонтан ок. 18 ° C. Уровень воды в листе печенья должна быть такой, что вода может течь в лунки корневой пластины, но не настолько глубок, что рассады в Саженец пластины погружаются. Если уровень воды не правильно вы должны будете получить другой лист печенья правильной глубине. Добавить дистиллированную воду периодически ледяная шапка Фонтан для поддержания первоначального уровня воды. При добавлении дистиллированной воды к фонтану заменитежидкости, утраченных в результате испарения без изменения минерального состава воды в фонтане. Уровень воды нужно проверять ежедневно в Ледовом-Cap фонтана. 4. Ткань Урожай корневой Корневые ткани собирают путем замораживания воды в корневой пластины, а затем пилинг Саженец пластины от корневой пластины. Накануне уборки корневой ткани, удалять сложены Ice-Cap Плиты из Ice-Cap фонтана. Вставьте три деревянных шампура между скважины сложены рассады и корневой пластины. Цель шампуры является повышение перья из рассады Плиты из скважин корневой пластины в рамках подготовки к замораживанию процесса. Разрешить сложены Ice-Cap Плиты с деревянными шампурами вставляется на ночь под огнями. Это позволяет небольшим инкубации испарение жидкости в корневой пластины, что облегчает последующее замораживание и процессов расстояния между пластинами. НаДень ткани урожая, подготовить замораживания ванну. Место 96-луночного металл теплового блока в блюдо пирекса смесью сухого льда и 95% этанола. Разрешить теплового блока, чтобы уравновесить в температуре ок. 20 минут. Место блюдо Pyrex на вершине какого-то типа из изоляционного материала, таких как автоклав рукавицей, чтобы низкая температура не повреждает поверхности лабораторного стола. Место сложены Ice-Cap плиты с деревянными шампурами в охлажденном теплового блока и инкубировать 5 минут. За это время вода в корневой пластины будет замораживать тела. Рассады в Саженец пластины не замерзнуть во время этого лечения и остаются полностью жизнеспособными. Удалить сложены Ice-Cap пластин из теплового блока и разместить их на лабораторном столе при комнатной температуре. Удалить резинки и деревянных шампуров из сложенных пластин. Твердо надавите на верхнюю часть рассады пластины, чтобы "взломать" пластин. Затем тщательно очистить пластины корней и рассады пластины APискусства. Разрешить воды в корневой пластины таять при комнатной температуре. Размораживание может быть ускорено путем инкубации корневой пластины в тепловом блоке установлена на уровне 25 ° C. 5. Магазин Саженец пластины при низкой температуре в темноте После ткани урожай, рассаду плиты можно хранить в темном месте при низкой температуре, которая будет поддерживать жизнеспособность рассады в то время как генотип анализ. Саженцы можно хранить при этих температурах в течение нескольких недель без ущерба для жизнеспособности. После сбора ткани, печать нижнюю часть рассады пластина с клейкой лентой. Место прозрачной пластиковой крышкой в верхней части пластины рассады и безопасный с микропористой лентой. Стек несколько пластин рассады вместе и завернуть в алюминиевую фольгу. Для Arabidopsis саженцы, место пластины при температуре 4 ° C. Для рассады томатов, места пластины при температуре 12 ° C. После генотипирования завершения себеedlings могут быть удалены из этой низкой температуры инкубации и пересадить в почву, как описано ниже. 6. Выделения ДНК ДНК подходящим для реакции ПЦР могут быть легко извлечены из образцов корневой ткани. Доходность от общего числа ДНК оправился от Arabidopsis образцов тканей корня ок. 400 нг в среднем 2. Убедитесь, что вода в корневой пластины имеет полностью оттаять перед выполнением процедуры экстракции ДНК. Проверьте пластины для определения наличия скважин существенно меньше воды, чем в среднем. Рука пипетки дистиллированной воды в скважины, которые требуют дополнительной воды. Используйте MicroFill машину, чтобы добавить 25 мкл Трис-ЭДТА раствором (500 мМ Трис, рН 8, 50 мМ ЭДТА, PH8) в каждую лунку корневой пластины. Печать скважин корневой пластины с использованием тепловых фольги герметизации и машина заварены. Место запечатанном пластин корня на GenoGrinder машина сзапечатанный конец пластины вниз. Эта пластинка ориентация обеспечивает оптимальную бусинку движения и предотвращает бусы из преткновения в скважинах. Встряхните пластин в GenoGrinder в течение 3 минут ½ при 1350 ударов в минуту. Передача пластин центрифуга с микропланшетов перевозчиков и спина пластин в течение 10 минут при 3500 RPM при температуре 4 ° С до гранул пыли корневой ткани. В результате разбавленный экстракт содержит геномной ДНК, которые могут быть непосредственно использованы в реакции ПЦР. Обычно один будет добавить 2 мкл этой ДНК экстракт реакции ПЦР. Для хранения образцов ДНК, печать микропланшет использованием клейкой упаковочной ленты и месте при температуре минус 20 ° C. Образцы ДНК можно хранить в течение нескольких месяцев без видимой потери качества. 7. Передача Сеянцы с Желаемый Генотип для почвы Как только генотип завершения анализа, саженцы с желаемым генотипом могут быть переданы от рассадыПластины в почву. Удалить Саженец Плиты из холодного хранения и подготовки горшки с водонасыщенных почвенную смесь. Для удаления отдельных рассады из рассады Plate, использование щипцов, что позволяет захватить агар плагин без дробления рассады. Захватите агар вилку щипцов и аккуратно сдвиньте агар вилку из рассады пластины будьте осторожны, чтобы не повредить рассаду. Кроме того, сжатый воздух может быть использован, чтобы аккуратно стрелять плагин агар и рассады из колодца. Надавите на небольшое отверстие в нижней части хорошо, пока вилка выскакивает на лабораторном столе. Подготовка маленькое отверстие в почве размер агар вилку. Место агар подключить почвы и упаковка влажную почву вокруг агар плагин для обеспечения рассады в грунт. Не пытайтесь удалить любой из агара из разных саженцев. Место пересаженной рассады в комнате роста в стандартных условиях роста. Обложка горшок с пластиковой крышкой дляПервые два дня после пересадки. Впоследствии снять крышку и продолжать выращивать растения с использованием стандартных условиях. 8. Представитель Результаты: Примером Arabidopsis рассаду выращивают использованием Ice-Cap системы показан на рисунке 4A. Эти саженцы были в Ледовом-Cap фонтана в течение двух недель, когда был сделан снимок, и были готовы к ткани урожая. Корневые ткани из этих же саженец показан на рисунке 4Б. Общее количество ДНК, выделенной из одного образца ткани Arabidopsis корень, как правило, в диапазоне от 100 до 700 нг нг 2. Этот выход расчет основан на использовании только одной порции сырого экстракта корня. Потому что только ок. 10% сырой экстракт корня обычно используется для экстракции ДНК, можно получить значительно больше геномной ДНК для анализа вниз по течению, сохраняя больше сырой экстракт. Общая сумма геномной ДНК, полученные с использованием Ice-Cap процедура достаточно выполнять сотни реакции ПЦР 2. Рисунок 1: Схема Ice-Cap процесса. ) Саженец пластины, содержащей агар питательной среды, на которой саженцы прорастают. Корни проникают агар и растут вниз, к нижней части пластины. Отверстия в дне скважины пластина запечатаны с клейкой пленки. Б) Саженец Пластина устанавливается на верхней части корневой пластины, содержащей воду и металлическим шариком. Корни выхода отверстия в дне скважины Саженец плиты и растут в лунки корневой пластины. С), деревянных шампура вставляются между пластины рассады и корневой пластины день до сложенных пластин Ice Cap помещаются в термоблока в сухой лед / этанол ванну. D) Как только вода в корневой пластины заморозил твердые, Сеянец пластины очищают от корневой пластины, что дает корневой пластины с 96 образцов тканейи рассады Тарелка с 96 жизнеспособных сеянцев. Деревянные шампуры облегчить разделение двух пластин на этом этапе. Рисунок 2: Фотографии пластины рассады и корневой пластины. ) Пластины рассады и корневой пластины видны раздельно. Б) Саженец пластины друг на корневой пластины. Стальные шарики используются для выделения ДНК можно увидеть в скважинах корневой пластины. Резинки используются для крепления двух пластин вместе. Рисунок 3: Ice-Cap фонтана. Ice-Cap фонтана используется для поддержания постоянного уровня воды при точной высоты вершины скважин корневой пластины. Это непрерывная система полива гарантирует, что вода в колодцах корневой пластины не истощаются из-за испарения или испарения. ) Самодельные стойкикоторая поддерживает лист печенья, на которых уложены Ice-Cap Плиты сидеть. Б) крупным планом одного из 1 "орехи, которые предоставляет средства благодаря настройке уровня для выпечки так, чтобы одинаковую глубину воды достигается по всей поверхности фонтана. C) Это изображение показывает все детали, необходимые для построения самодельные стойки для Ice-Cap фонтана. D) собрал Ice-Cap фонтана. погружной насос фонтана постоянно перемещает воду из нижнего резервуара для выпечки, которая покоится на вершине самодельных стойку. подпружиненный зажим используется для присоединения шланга к краю лист печенья. Рисунок 4: Arabidopsis рассаду выращивают использованием Ice-Cap процесса. ) Вид сверху смотрит вниз на две скважины Саженец плиты. Каждая лунка содержит Arabidopsis рассады. В) Вид сбоку двух скважин корневой пластины. Корни можно увидеть скручиваниевокруг внутренней поверхности скважины. Саженцы в этой картине была в Ледовом-Cap Фонтан для ок. две недели, и находятся на стадии роста, где ткань урожая, как правило, выполняется.
Discussion
Ice-Cap метод, представленный здесь позволяет ученым собирать образцы тканей из сотен или даже тысяч отдельных растений в течение одного дня и эффективно извлекать геномной ДНК из этих образцов для использования в генотипирования реакций. Давая отдельного ученого способность генотипа тысяч саженцев в течение короткого периода времени, Ice-Cap метод имеет потенциал, чтобы облегчить количество генетических экспериментов, которые иначе не могли бы быть практичным для выполнения. Некоторые примеры приведены ниже.
- Генетическое картирование. Мелкомасштабные генетическое картирование может быть ускорено, если исследователь имеет возможность определить рекомбинации в пределах определенного интервала по хромосоме 3. Если этот интервал включает в себя очень короткий генетическое расстояние, то рекомбинация события будут относительно редки в разделении отображение населения. По этой причине, может быть необходимо, чтобы экран тысячи отдельных предприятий, чтобы найти нужную повторноcombinant лиц. Этот процесс может быть значительно ускоренную за счет использования Ice-Кап. Даже в эпоху генома повторное секвенирование, все-таки необходимо, чтобы непосредственно показать, что данный мутацию несет прямую ответственность за фенотип интерес. В этих случаях необходимо будет отделить мутации интерес от других тесно связаны мутации, чтобы доказать, кандидат мутации фактически причинным. В таких ситуациях, Ice-Cap обеспечит эффективный метод для взлома связь между парой тесно связаны мутации.
- Multi-мутантов. Это стало общим для исследователей, изучающих Arabidopsis объединить мутантных аллелей из нескольких различных локусов в одной личности в целях преодоления функциональной избыточностью 4-6. В качестве примера, рассмотрим случай, когда кто-то хочет совместить мутантных аллелей из четырех различных локусов на одном заводе с помощью генной переправы. Для этого проекта нужно будет генерироватьн физическое лицо, является гетерозиготной по этим четырем локусам как часть пересечения схеме. Когда эта четверка-гетерозигот наборов семян, четырехместные гомозиготы как ожидается, будет присутствовать на курс одной из 256 в результате чего население потомства. Скрининг на этот редкий человек традиционными методами было бы весьма трудоемким. Для сравнения, с помощью Ice-Cap для этого проекта даст ученым с эффективной стратегии для выявления редких четырехместные гомозиготы в одном поколении.
- iTILLING. В нашей лаборатории недавно описан новый подход к скрининга на наличие индуцированных мутаций в генах, интерес к Arabidopsis 7. Этот метод является вариацией на установленные технику, называемую обработкой, которая используется, чтобы найти мутации в упорядоченных популяции лиц обработанные химическими мутаген 8-10. Мы назвали наш метод iTILLING, потому что это индивидуальный вариант обработки почвы, что позволяет индividual ученым сделать что-то, что традиционно требуется большая исследовательская группа, чтобы закончить. Ice-Cap является неотъемлемой частью метода iTILLING 7, как описано ниже.
Идея iTILLING является производство эфемерные мутант населения, которое резко контрастирует с прочным мутантных популяций создан для традиционной вспашки проектов. Для iTILLING, семена из наливных М2 населения высевают в 50 до 100 блоков Ice Cap, и ДНК извлекали с помощью Ice-Cap метод. Arabidopsis рассаду помещают при температуре 4 ° С, а мутация скрининг проводится с использованием Ice-Cap ДНК Готовые. Томатный саженцы хранятся при температуре 12 ° С.. Как только сеянцы проведения желаемой мутации были идентифицированы, они оправились от Ice-Cap плит и передано в почву. iTILLING не предназначен для обеспечения длительного мутант населения за весь научно-исследовательского сообщества экране. Вместо этого, iTILLING обеспечивает стратегию, котораяодин ученый не может экрана пользовательского мутант населения за мутации в нескольких генах быстро, эффективно, и при относительно низких затратах.
Мы обнаружили, Ice-Cap быть эффективным методом для выращивания и генотипирования Arabidopsis, помидор, и рис. Мы ожидаем, что другие виды растений также должны поддаваться Ice-Кап. Одно из ограничений на различные виды, которые могут быть размещены на Ice-Cap является размер семян. Только растения с семенами достаточно небольшим по размеру в лунки 96-луночного планшета будут совместимы с ледяная шапка в ее нынешней конфигурации.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась за счет гранта Национального научного фонда (грант № MCB-0447750).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
| ABgene Thermo-Sealer | ABgene USA | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
| Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
| MicroFill Microplate Dispenser | BioTek www.biotek.com |
AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
| Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
| Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
| 33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet |
| 30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
| Hose for fountain pump | Any lab supply company | Hose compatible with fountain pump | |
| Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
| Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Falcon www.bdbiosciences.com |
351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| 3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
| 3 inch Elastic hair bands | Local grocery store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
| 4 mm diameter wooden skewers | Local grocery store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
| Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
| Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
| Agar – cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
| Easy Peel heat sealing foil | ABgene USA | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
| Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd | OfficeMax www.officemax.com |
Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
| Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
| 96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
| Whatman Filter paper | Whatman International | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
| Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. |
References
- Clark, K. A., Krysan, P. J. Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0). Plant Methods. 3, 8-8 (2007).
- Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis. Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).
- Jander, G. Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).
- Liljegren, S. J. SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis. Nature. 404, 766-770 (2000).
- Buechel, S. Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration. Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).
- Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis. Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery. Plant J. 45, 684-694 (2006).
- Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).
Cite This Article
Su, S., Clark, K. A., Gibbs, N. M., Bush, S. M., Krysan, P. J. Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping. J. Vis. Exp. (57), e3280, doi:10.3791/3280 (2011).