الايس كاب : منهج في تزايد Arabidopsis الطماطم والنباتات في لوحات 96 - جيدا لالرفيع المناولة التنميط الجيني
Summary
الأسلوب آيس كاب يسمح احد لتنمو النباتات في لوحات 96 – جيدا وغير المدمر أنسجة الجذر الحصاد من كل الشتلات. ويمكن استخدام الحمض النووي المستخرج من نسيج هذا الجذر لتفاعلات التنميط الجيني. لقد وجدنا أن الآيس كاب يعمل بشكل جيد لل<em> thaliana Arabidopsis</em> والطماطم والأرز والشتلات.
Abstract
أنه أصبح من الشائع للعلماء النبات لتطوير المشاريع التي تتطلب التنميط الجيني لأعداد كبيرة من النباتات. الخطوة الأولى في أي مشروع التنميط الجيني هو جمع عينة من نسيج كل مصنع على حدة. النهج التقليدي لهذه المهمة هو عينة واحدة النباتات المعرضة للوقت. إذا كان أحد يرغب في التركيب الوراثي أو مئات الآلاف من الأفراد ، إلا أن استخدام هذه النتائج الاستراتيجية في اختناق كبير في خط أنابيب التنميط الجيني. الأسلوب آيس كاب التي وصفنا هنا يوفر حلا عالي الإنتاجية لهذا التحدي من خلال السماح لأحد العلماء جمع الأنسجة من عدة آلاف من شتلات 1،2 في يوم واحد. يتكون هذا المستوى من سرعة ممكنة من خلال حقيقة أن الأنسجة التي تحصد من النباتات المعرضة لل96 مرة ، بدلا من واحد في وقت واحد في.
الأسلوب آيس كاب يوفر منصة متكاملة لأداء نمو الشتلات والحصاد الأنسجة ، واستخلاص الحمض النووي. الأساس لآيس كاب هو نمو seedliNGS في زوج من مرصوف 96 – جيدا لوحات. آبار لوحة تحتوي على شمعات العلوي من وسائط النمو التي أغار على الشتلات الفردية تنبت. الجذور تنمو باستمرار عبر وسائل الإعلام آغار ، الخروج من لوحة العلوي من خلال ثقب ، وتمر في المياه التي تحتوي على أقل وحة. لحصاد الأنسجة لاستخراج الحمض النووي ، والماء في الطبقة السفلى من لوحة تحتوي على أنسجة الجذر المجمدة بسرعة في حين أن الشتلات في الصفيحة العليا تبقى في درجة حرارة الغرفة. غير المقشر ثم لوحة العليا بعيدا عن انخفاض لوحة ، مما أسفر عن إحدى الصفائح مع 96 عينات الأنسجة المجمدة في جذر واحد لوحة الجليد مع 96 شتلة قابلة للحياة. يسمى هذا الأسلوب "آيس كاب" لأنه يستخدم الثلج لالتقاط الأنسجة الجذر. يمكن للوحة 96 – جيدا يحتوي على شتلات ملفوفة في احباط وثم نقل إلى درجة حرارة منخفضة. علقت هذه العملية مزيدا من النمو من الشتلات ، ولكن لا يؤثر على قدرتها على الاستمرار. مرة واحدة وقد تم الانتهاء التحليل الوراثي ، يمكن نقل الشتلات مع التركيب الوراثي المطلوب من ع 96 – جيدافي وقت متأخر إلى التربة لمزيد من الانتشار. لقد أثبتنا في جدوى الأسلوب الآيس كاب باستخدام thaliana Arabidopsis ، والبندورة ، وشتلات الأرز. نتوقع أن الأسلوب يجب أن تنطبق أيضا على أنواع أخرى من النباتات ذات البذور صغيرة بما يكفي لتناسب آبار 96 – جيدا لوحات.
Protocol
1. إعداد لوحات الشتلة الآيس كاب مع وسائط النمو آجار والاستغناء عن وسائط النمو المنصهر (0.5X Murashige وسكوغ (MS) خليط الملح القاعدية ، 2 مم Morpholinoethanesulfonic حمض (MES) ، أغار 0.6 ٪ (W / V) ، ودرجة الحموضة 5.7) في لوحات الشتلة تعقيمها باستخدام مصدر Microplate MicroFill. وهناك حاجة ليتر واحد من وسائل الإعلام في لوحات الشتلة 18. إعداد وسائط النمو في واحدة قناني زجاجية ليتر مع أغطية رأس المسمار والأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة. الأوتوكلاف لتر واحد من الماء المقطر في زجاجة مع غطاء رأس المسمار. في الوقت نفسه أيضا لوحات الأوتوكلاف الشتلة فارغة ملفوفة في رقائق الألومنيوم. نقل وسائل الإعلام تعقيمها والمياه لمجموعة حاضنة عند 65 درجة مئوية. وسوف تحافظ على درجة الحرارة هذه وسائط النمو في حالة منصهرة. بعد التعقيم ، وإزالة لوحات الشتلة من احباط ومكان في غطاء تدفق الصفحي لتجف. يجب أن تكون لوحات يجف تماما قبل الشروع بحيث الشريط اللاصق يمكن التعبئةالختم تماما ثقوب في قاع الآبار من لوحات. مسح أسفل المختبرات مع الايثانول 95 ٪ لتعقيم. نقع الأغطية البلاستيكية واضحة لوحات الشتلة في الايثانول 95 ٪ لتعقيم. إزالة الأغطية من الايثانول والهواء الجاف في غطاء تدفق الصفحي. لا الأغطية البلاستيكية الأوتوكلاف لتعقيم لها ، لأنها سوف تذوب في الأوتوكلاف. تطبيق الشريط التعبئة إلى أسفل كل لوحة الشتلة وختم بحزم باستخدام أداة الدوارة. ضع زجاجة من وسائط النمو المنصهر والماء المعقم في حمام مائي وضعت في 65 درجة مئوية. نعلق زجاجة تحوي الايثانول 70 ٪ في درجة حرارة الغرفة إلى جهاز MicroFill وتشغيل دورة تطهير مرتين لتطهير سمكرة الجهاز MicroFill. نعلق الزجاجة مع الماء المعقم إلى الجهاز MicroFill. تشغيل دورة تطهير ست مرات لتدفئة السباكة واضحة على الايثانول من النظام. ينبغي أن تظل زجاجة ماء في الحمام 65 درجة مئوية خلال هذا الإجراء. بعد الانتهاء من عمليات التطهير بماء معقم ، نعلق على الفور زجاجة من وسائط النمو المنصهر إلى الجهاز MicroFill. تشغيل دورة تطهير مرتين لمسح الماء المقطر من السباكة. وينبغي أن الزجاجة من وسائط النمو لا تزال في الحمام 65 درجة مئوية خلال هذا الإجراء. الاستغناء عن 450 microliters من وسائط النمو في كل من آبار بلايت الشتلة. العمل بسرعة حتى ان وسائل الاعلام النمو لا يصلب في السباكة الجهاز MicroFill. عندما يتم شغل كل من لوحات الشتلة ، نعلق على الفور زجاجة من 65 درجة مئوية الماء المعقم إلى الجهاز MicroFill وتشغيل دورة تطهير 12 مرة لتنظيف السباكة. ينبغي أن تظل زجاجة ماء في الحمام 65 درجة مئوية خلال هذا الإجراء. إذا كان الجهاز MicroFill غير متوفرة ، ويمكن أيضا لوحات الشتلة التي ستعدها اليد pipetting آغار المنصهر في لوحات مغلقة باستخدام pipettor الأقنية. فحص الآبار من كل لوحات ر الشتلةس ضمان نمو وسائل الإعلام لم تتسرب أي الآبار. ومن ناحية أخرى ماصة وسائط النمو المنصهر في الآبار الفردية حسب الحاجة. كل لوحة الغلاف مع غطاء من البلاستيك واضحة ، والسماح لوسائل الإعلام لترسيخ النمو في لوحات الشتلة في درجة حرارة الغرفة. لوحات والتفاف مكدس في رقائق الألومنيوم للتخزين عند 4 درجات مئوية. لوحات تخزين رأسا على عقب لمنع تراكم المياه في الآبار خلال التخزين. 2. لوحات في زرع بذور الشتلة آيس كاب والشتلات ينبت لقد وصفنا سابقا أسلوبا شبه الآلي للاستغناء بذور Arabidopsis في لوحات الشتلة باستخدام جهاز شحن البذور (2). على الرغم من أن هذا الجهاز يمكن أن يكون مفيدا لبعض دفعات من البذور ، ولقد وجدنا أن التباين في حجم البذور المعروضة بواسطة دفعات مختلفة من البذور Arabidopsis يحد من المرافق العامة لهذا الجهاز. نحن في عملية تطوير أسلوب بديل الآلي للاستغناء البذور ، بور في الوقت الحاضر وجدنا أن الاستراتيجية الأكثر فعالية لتوزيع البذور في لوحات الشتلة في تنفيذ هذه الخطوة يدويا كما هو موضح أدناه. رش البذور الجافة على الورق مرشح Whatman. الاستغناء عن 95 ٪ من الإيثانول على البذور بحيث تتم تغطية كل من البذور مع الايثانول. وهذه المعالجة السطحية تعقيم البذور. تسمح بذور في الهواء الجاف. نقل البذور الفردية في آبار لوحات الشتلة باستخدام الزجاج القابل للتصرف تعديل ماصة باستور. غير مختومة نهاية ماصة باستير التي المشتعلة غيض. هو مبلل غيض من الزجاج الناجم عن لمس برفق إلى وسائل الإعلام آغار ، الذي يسمح لتكون البذور واحدة التقطت بسهولة ونقلها إلى السطح من الآبار في آغار من اللوحة الشتلة. ويمكن أيضا إصدار برأسين من هذه البذور أداة الطلاء يمكن استخدامه لزيادة الإنتاجية. تغطي كل لوحة الشتلة مع غطاء من البلاستيك واضحة وختم الشريط مع Micropore الجراحية. التفاف على لوحات مكدسةمع رقائق الألومنيوم والبذور Arabidopsis تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة أربعة أيام لتراصف البذور ومزامنة الإنبات. يجب أن يتم تخزين بذور الطماطم في الظلام في 12 درجة مئوية لمدة أربعة أيام. وضع لوحات الشتلة تحت ضوء الفلورسنت عند 18 درجة الى 20 درجة مئوية إلى الشروع في الإنبات. 3. لوحات نقل الشتلات إلى الآيس كاب نافورة بعد لوحات الشتلة كانت تحت الضوء لمدة أربعة أيام ، ونقل لوحات الشتلة إلى نافورة الآيس كاب. لArabidopsis ، تترك عادة الشتلات في الثلج نافورة كاب لمدة 10 إلى 14 يوما. تجميع نافورة الآيس كاب وذلك بوضع ورقة الكعكة في أعلى هيكل رف مخصص التي وضعت داخل علبة تخزين بلاستيكية. استخدام المكسرات التسوية لضبط مستوى ورقة الكعكة. وضع مضخة غاطسة في مربع التخزين ونعلق خرطوم الإخراج من المضخة إلى جانب ورقة الكعكة باستخدام الربيع محملة CLAالنائب. تجميع نافورة الآيس كاب على الرف في غرفة النمو النباتية أو حجرة النمو بحيث سطح نافورة الآيس كاب يتلقى الإضاءة الفلورسنت المباشرة. ملء نافورة الآيس كاب مع خليط من 3 أجزاء من الماء المقطر إلى 1 جزء ماء الصنبور. وينبغي أن يضاف الماء إلى النافورة حتى مضخة غاطسة وعدة سنتيمترات تحت مستوى المياه. بمناسبة منسوب المياه النهائي في المربع التخزين البلاستيكية باستخدام الشريط المختبر وقلم الوسم. إعداد لوحات الجذر بإضافة أحد 3/32-inch الكرة الفولاذ المقاوم للصدأ قطرها إلى كل بئر من لوحة الجذر. يمكن إضافة كرات الفولاذ المقاوم للصدأ لوحات الجذر باستخدام العرف الكرة الاستغناء عن الجهاز 1. يتكون هذا الجهاز من خلال وضع ورقة واحدة من رقائق الألومنيوم على سطح اللوحة بشكل جيد 96 – PCR واستخدام القلم للاحتفال بمناسبة مواقع مراكز كل بئر على السطح من احباط. ثم يتم وضع هذه الورقة ملحوظ في احباط على أعلى من 6 صفحات إضافية من الألمنيوم للايل وملفوفة حول سطح أملس من غطاء من مربع ماصة تلميح المستخدمة. ثم يتم استخدام أداة حادة مثل سيخ خشبي لإنشاء و divot كبيرة بما يكفي لاجراء بكرة معدنية واحدة في كل موقع من المواقع 96. لملء هذا الجهاز الاستغناء عن الكرات ، ويصب وجود فائض من كرات معدنية على الجهاز ، وتهتز برفق لإزالة الكرات الزائدة. ثم يتم وضع اللوحة في الجذر على الجزء العلوي من الجهاز وصرفها ، والتي انقلبت إلى قطرة واحدة في كل الكرة جيدا بلايت الجذر. إضافة 340 microliters من خليط من 3 أجزاء من الماء المقطر إلى 1 جزء ماء الصنبور إلى كل بئر من اللوحة باستخدام آلة الجذر MicroFill. تأكد من أنه قد تمت إضافة كرات الصلب لوحات الجذر قبل الاستغناء عن الماء. قشور لاصقة الفيلم قبالة الجزء السفلي من لوحات الشتلة وإزالة الأغطية البلاستيكية واضحة من لوحات. كل مكان اللوحة الشتلة في صفيحة تحتوي على الجذر الكرة المعدنية والمياه وتأمين لوحات اثنين معا باستخدام اثنين هاي دنةعصابات ص. ضع مكدسة آيس كاب لوحات في نافورة آيس كاب. لا ينبغي أن الأغطية البلاستيكية واضحة عندما يتم استخدام لوحات هي في نافورة الآيس كاب. تحقق للتأكد من ذلك أيضا هو الانحياز A – 01 من اللوحة مع الشتلة 01 – A جيدا بلايت الجذر. ينبغي أن تترك مكدسة الشتلة / الجذر لوحات في نافورة الآيس كاب حتى الغالبية العظمى من الشتلات والأنسجة الجذرية التي قد توغلوا في لوحات الجذر. درجة الحرارة المثالية لنمو الشتلات Arabidopsis في نافورة الآيس كاب كاليفورنيا. 18 درجة مئوية. وينبغي أن مستوى المياه في ورقة تكون هذه الكعكة التي يمكن أن تتدفق المياه في الآبار لوحات من الجذر ، ولكن ليست عميقة بحيث يتم غمر الشتلات الشتلة في اللوحة. إذا كان مستوى الماء غير صحيحة وسوف تحتاج إلى الحصول على ورقة الكعكة مختلفة من العمق الصحيح. إضافة الماء المقطر بشكل دوري لنافورة الآيس كاب للحفاظ على مستوى الماء الأصلي. وذلك بإضافة الماء المقطر إلى الينبوع النقي سوف يحل محلفقدان السوائل بسبب التبخر دون تغيير التركيبة المعدنية من المياه في النافورة. ينبغي فحص مستوى المياه يوميا في نافورة الآيس كاب. 4. حصاد جذر الأنسجة يتم حصاد الأنسجة الجذرية من خلال تجميد الماء في اللوحة الجذر ثم تقشير بلايت الشتلة بعيدا عن اللوحة الجذر. قبل يوم الحصاد أنسجة الجذر ، إزالة الجليد رسملة مكدسة لوحات من نافورة آيس كاب. إدراج ثلاثة أسياخ خشبية بين الآبار من الشتلات لوحات مكدسة والجذر. الغرض من أسياخ هو رفع حبيبات من لوحات الشتلة من الآبار لوحات الجذر في التحضير لعملية التجميد. السماح للآيس كاب مكدسة لوحات خشبية مع أسياخ المدرجة على الوقوف ليلا تحت الاضواء. هذا الاحتضان يسمح التبخر طفيف للسيولة في لوحات روت ، مما يسهل لاحقا ، وتجميد عمليات فصل لوحة. فييوم الحصاد الأنسجة ، ويعد الحمام التجمد. مكان كتلة معدنية 96 – جيدا الحرارية في طبق بيركس مع خليط من الثلج الجاف والايثانول 95 ٪. السماح للكتلة الحرارية للتوازن في درجة الحرارة لكاليفورنيا. 20 دقيقة. وضع طبق بيركس على أعلى نوع من المواد العازلة مثل الأوتوكلاف القفاز بحيث درجة حرارة منخفضة لا ضرر على سطح مقاعد البدلاء المختبر. ضع مكدسة آيس كاب لوحات مع أسياخ خشبية إلى عرقلة الحرارية المبردة واحتضان لمدة 5 دقائق. خلال هذا الوقت فإن الماء في اللوحة الجذر تجميد الصلبة. الشتلات في اللوحة الشتلة لا تجميد خلال هذا العلاج وتبقى قابلة للتطبيق تماما. إزالة الجليد رسملة مكدسة لوحات من كتلة حرارية ووضعها على مقاعد البدلاء المختبر في درجة حرارة الغرفة. إزالة أربطة مرنة وأسياخ خشبية من لوحات مكدسة. اضغط بإحكام الخناق على الجزء العلوي من اللوحة الشتلة الى "الكراك" لوحات. بعناية ثم قشر اللوحة واللوحة جذر الشتلة APالفن. السماح للمياه في لوحات الجذر إلى ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. ويمكن تسريع ذوبان التي يحتضنها لوحات الجذر في كتلة الحرارية التي حددت في 25 درجة مئوية. 5. تخزين اللوحة الشتلة في درجات حرارة منخفضة في الظلام بعد الحصاد الأنسجة ، يمكن تخزين لوحات الشتلات في الظلام في درجات الحرارة المنخفضة التي سوف تحافظ على بقاء الشتلات أثناء إجراء التحليل الوراثي. ويمكن تخزين هذه الشتلات في درجات الحرارة لعدة أسابيع دون أن يؤثر البقاء. بعد الحصاد الأنسجة ، وختم الجزء السفلي من لوحة الشتلات بشريط لاصق. وضع غطاء من البلاستيك واضحة على الجزء العلوي من اللوحة الشتلة وآمنة مع الشريط micropore. المكدس لوحات عدة الشتلة معا والتفاف في رقائق الألومنيوم. لشتلات Arabidopsis ، وضع لوحات في 4 درجات مئوية. لشتلات الطماطم ، ووضع لوحات على 12 درجة مئوية. التنميط الجيني مرة واحدة كاملة ، في حد ذاتهيمكن إزالة edlings من هذا الاحتضان درجات الحرارة المنخفضة وزرعها في التربة كما هو موضح أدناه. 6. استخراج الحمض النووي يمكن أن تكون مناسبة للتفاعلات الحمض النووي المستخرج PCR بسهولة من عينات الأنسجة الجذر. العائد من الحمض النووي من مجموع ما استرد Arabidopsis عينات الأنسجة الجذر كاليفورنيا. 400 نانوغرام في المتوسط 2. تأكد من أن المياه في لوحات الجذر وقد تحسنت تماما قبل تنفيذ الإجراء استخراج الحمض النووي. فحص لوحات لتحديد ما إذا كان لديهم مياه الآبار أي أقل بكثير من المتوسط. ماصة ناحية الماء المقطر في الآبار التي تتطلب كميات إضافية من الماء. تستخدم الآلة MicroFill لإضافة 25 microliters حل تريس – EDTA (500 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 8 و 50 ملي EDTA ، pH8) إلى كل بئر من لوحات الجذر. اغلاق آبار لوحات باستخدام الجذر الحرارية احباط الختم وآلة ختم الحرارة. وضع لوحات الجذر مختومة على الجهاز مع GenoGrinderأغلقت نهاية لوحات أسفل. هذا التوجه لوحة يوفر حركة حبة الأمثل ويمنع حبات من الالتصاق في الآبار. هزة في لوحات GenoGrinder لدقائق ونصف 3 في 1350 السكتات الدماغية في الدقيقة الواحدة. نقل لوحات لأجهزة الطرد المركزي مع شركات microplate وتدور لوحات لمدة 10 دقيقة عند 3500 دورة في الدقيقة عند 4 درجة مئوية لتكوير النسيج الجذر المسحوق. استخراج الحمض النووي الناتج المخفف يحتوي الجينوم التي يمكن استخدامها مباشرة في التفاعلات PCR. عادة سوف نضيف 2 microliters هذا استخراج الحمض النووي لتفاعل PCR. لتخزين عينات الحمض النووي ، وختم microplate باستخدام شريط لاصق في مكان التعبئة وناقص 20 درجة مئوية. ويمكن تخزين عينات من الحمض النووي لعدة أشهر مع عدم وجود واضح في الحد من الجودة. 7. نقل الشتلات مع الوراثي المطلوب لتربة بمجرد اكتمال التحليل الوراثي ، يمكن نقل الشتلات مع التركيب الوراثي المطلوب من الشتلاتلوحات للتربة. إزالة لوحات الشتلة من التخزين البارد ، وإعداد الأواني مع خليط التربة المشبعة بالمياه. لإزالة الشتلات الفردية من اللوحة الشتلة ، واستخدام الملقط الذي يسمح احد لانتزاع القابس آغار دون سحق الشتلات. الاستيلاء على المكونات آغار مع ملقط والشريحة بلطف قابس آغار من اللوحة الشتلة والحرص على عدم الإضرار الشتلات. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الهواء المضغوط لاطلاق النار بلطف قابس آغار والشتلات من البئر. الضغط على ثقب صغير في قاع البئر حتى قابس الملوثات العضوية الثابتة على مقاعد البدلاء المختبر. إعداد حفرة صغيرة في التربة حجم المكونات آغار. وضع المكونات أجار في التربة والتربة رطبة حول حزمة المكونات آغار لتأمين الشتلات في التربة. لا تحاول إزالة أي من آغار من حول الغرسات. وضع الشتلات المزروعة في غرفة النمو في ظل ظروف النمو القياسية. تغطية وعاء مع غطاء بلاستيكي للأول يومين بعد الزرع. إزالة الغطاء في وقت لاحق وتستمر في النمو واستخدام النباتات الظروف القياسية. 8. ممثل النتائج : ويظهر مثال الشتلات Arabidopsis نمت باستخدام نظام آيس كاب في الشكل 4A. كان لهذه الشتلات تم في نافورة الآيس كاب لمدة أسبوعين عندما تم التقاط هذه الصورة وكانت جاهزة للحصاد الأنسجة. ويظهر من هذه الأنسجة الجذر البادرة في نفس الشكل 4B. المبلغ الإجمالي من الحمض النووي المستخرج من عينة واحدة من نسيج الجذر Arabidopsis عادة في حدود 100 إلى 700 نانوغرام نانوغرام 2. ويستند هذا الحساب العائد على استخدام جزء واحد فقط من استخراج الجذر الخام. فقط لأن كاليفورنيا. وعادة ما تستخدم 10 ٪ من استخراج الجذر الخام لعملية استخراج الحمض النووي ، فمن الممكن الحصول على الحمض النووي بشكل كبير أكثر الجينومية لتحليل اتجاه مجرى النهر من خلال الاحتفاظ أكثر من استخراج النفط الخام. الحصول على المبلغ الإجمالي من الحمض النووي الجيني باستخدام الجليدالإجراء غطاء كافيا لتنفيذ مئات من ردود الفعل PCR 2. الشكل 1 : مخطط التدفق لعملية الآيس كاب. A) التي تحتوي على لوحة الشتلة وسائط النمو التي أغار على الشتلات تنبت. جذور تخترق آغار وينمو باستمرار نحو الجزء السفلي من اللوحة. وختم ثقوب في قاع الآبار من لوحة مع الفيلم لاصقة. B) هي مكدسة واللوحة الشتلة على رأس الجذر اللوحة التي تحتوي على الماء وكرة معدنية. جذور الخروج من الثقوب الموجودة في قاع الآبار من اللوحة الشتلة وتنمو لتصبح آبار للبليت الجذر. ج) يتم إدراج أسياخ خشبية بين اللوحة واللوحة الشتلة الجذر قبل يوم وضعت الغطاء الجليدي لوحات مكدسة في thermoblock في حمام الثلج / الايثانول الجاف. D) وبمجرد أن المياه في اللوحة الجذر جمدت الصلبة ، هو مقشر بليت الشتلة بعيدا عن اللوحة الجذر ، مما يعني أن اللوحة الجذر مع عينات الأنسجة 96واللوحة الشتلة مع 96 شتلة قابلة للحياة. في أسياخ خشبية تسهيل فصل الصفيحتين خلال هذه الخطوة. الشكل 2 : صور فوتوغرافية من اللوحة واللوحة الشتلة الجذر. أ) بلايت الشتلة واللوحة الجذر ينظر بشكل منفصل. ب) صحن الشتلة مكدسة على رأس اللوحة الجذر. ويمكن رؤية الكرات الفولاذية المستخدمة لاستخراج الحمض النووي في الآبار لوحة الجذر. وتستخدم العصابات مرنة لتأمين لوحات اثنين معا. الرقم 3 : نافورة الآيس كاب. يتم استخدام نافورة الآيس كاب للحفاظ على مستوى ثابت للمياه في ذروة دقيقة من قمم آبار لوحات الجذر. هذا النظام يضمن أن سقي مستمر لا تصبح المياه في الآبار لوحات الجذر المنضب بسبب التبخر أو النتح. أ) محلية الصنع الرفالتي تدعم ورقة الكعكة التي مكدسة على الجليد لوحات رسملة الجلوس. ب) وجهة نظر عن قرب واحد من المكسرات "(1) الذي يوفر وسيلة لضبط بدقة مستوى ورقة الكعكة بحيث يتم التوصل إلى عمق المياه موحدة في جميع أنحاء سطح الينبوع. C) هذه الصورة يعرض كافة الأجزاء اللازمة لبناء منزل من صنع رف لنافورة الآيس كاب دال) وتجميعها الآيس كاب النافورة. مضخة غاطسة يتحرك باستمرار نافورة المياه من الخزان السفلي إلى ورقة الكعكة ، والتي تقع على قمة محلية الصنع رف. يستخدم المشبك ربيع تحميل نعلق خرطوم إلى حافة الورقة الكعكة. الشكل 4 : شتلات Arabidopsis نمت باستخدام عملية الآيس كاب. أ) عرض الأعلى غمط في بئرين لوحة الشتلة. كل بئر يحتوي على الشتلات Arabidopsis. ب) عرض الجانب من بئرين لوحة الجذر. ويمكن رؤية جذور التواءحول السطح الداخلي للآبار. كان الشتلات في هذه الصورة كانت في نافورة آيس كاب لكاليفورنيا. اسبوعين وهما في مرحلة النمو حيث عادة الحصاد الأنسجة من الممكن أن يقوم به.
Discussion
الأسلوب آيس كاب المعروضة هنا تمكن أحد العلماء لجمع عينات الأنسجة من مئات ، بل آلاف ، من النباتات الفردية في يوم واحد واستخراج الحمض النووي الجيني بكفاءة من تلك العينات لاستخدامها في التفاعلات التنميط الجيني. عالم من خلال إعطاء الفرد القدرة على التركيب الوراثي آلاف شتلة في فترة قصيرة من الزمن ، وطريقة الآيس كاب لديه القدرة على تيسير عدد من التجارب الجينية التي لن يكون الأمر خلاف ذلك لتنفيذ العملية. وتقدم العديد من الأمثلة أدناه.
- رسم الخرائط الجينية. يمكن التعجيل غرامة النطاق رسم الخرائط الجينية إذا كان الباحث غير قادرة على تحديد الأحداث التوحد ضمن فاصل زمني محدد على طول الكروموسوم 3. إذا كان هذا الفاصل الزمني ينطوي على بعد مسافة قصيرة جدا الجينية ، فإن الأحداث التي وقعت تأشب تكون نادرة نسبيا في فصل السكان الخرائط. لهذا السبب ، قد يكون من الضروري آلاف شاشة النباتات الفردية للعثور على إعادة المرجوةcombinant الأفراد. ويمكن تسريع هذه العملية إلى حد كبير من خلال استخدام كاب الجليد. حتى في عصر الجينوم على نطاق التسلسل من جديد ، فإنه لا يزال من الضروري أن تظهر مباشرة طفرة معينة هي المسؤولة مباشرة عن النمط الظاهري في المصالح. في هذه الحالات ، سوف يكون من الضروري التفريق بين طفرة الاهتمام بعيدا عن غيرها من الطفرات ترتبط ارتباطا وثيقا من أجل إثبات وجود طفرة مرشح هو في الواقع المسبب للمرض. في هذه الحالات ، فإن الآيس كاب توفير وسيلة فعالة لكسر الربط بين زوج من طفرات مرتبطة بإحكام.
- متعدد المسوخ. لقد أصبح من الشائع بالنسبة للباحثين الذين يدرسون Arabidopsis الجمع بين الأليلات الطافرة من مواضع عدة متميزة في فرد واحد من أجل التغلب على التكرار وظيفية 4-6. كمثال على ذلك ، والنظر في الحالة التي يكون فيها أحد يرغب في الجمع بين الأليلات الطافرة من أربعة مواضع مختلفة في مصنع واحد من خلال معبر الوراثية. لهذا المشروع ، وسوف يكون من الضروري إنشاءن الفرد هو متخالف في هذه مواضع الأربعة جزء من خطة العبور. عندما تكون هذه البذور مجموعات رباعية ، متغايرة ، من المتوقع أن زيجوت متماثلة الألائل الرباعي أن يكون حاضرا في معدل واحد من أصل 256 في عدد السكان الناتجة من النسل. ان الكشف عن هذا الشخص بالطرق التقليدية نادرة يكون العمل المكثف جدا. وبالمقارنة ، فإن استخدام آيس كاب لهذا المشروع يوفر للعالم مع استراتيجية فعالة لتحديد زيجوت متماثلة الألائل النادرة أربعة أضعاف في غضون جيل واحد.
- iTILLING. مختبرنا وصف مؤخرا نهجا جديدا لتحري وجود الطفرات المستحثة في الجينات ذات الأهمية في 7 Arabidopsis. هذا الأسلوب هو الاختلاف على أسلوب يسمى الحرث المنشأة التي تستخدم لإيجاد طفرات في أمر السكان من الأفراد تعامل مع المواد الكيميائية مطفر 8-10. وقد سميت نحن لدينا وسيلة لأنه iTILLING إصدار فردية من حراثة الذي يسمح لدائرة الهجرة والجنسيةعالم ividual لإنجاز شيء ما قد يلزم تقليديا فريق بحثي كبير لإكمال. الايس كاب يشكل جزءا لا يتجزأ من أسلوب iTILLING 7 ، كما هو موضح أدناه.
الفكرة وراء iTILLING هو إنتاج مجموعة سكانية سريعة الزوال متحولة ، والتي تقف على النقيض من سكان متحولة الدائم لخلق مشاريع حراثة التقليدية. لiTILLING ، وزرعت بذور من سكان M2 متضخم في 5-10 كتل الجليد كاب ، ويتم استخراج الحمض النووي باستخدام طريقة رسملة الجليد. ثم توضع الشتلات Arabidopsis في 4 درجات مئوية في حين يتم تنفيذ فحص الحمض النووي الطفرة باستخدام الآيس كاب محضرات. يتم تخزين شتلات الطماطم على 12 درجة مئوية. مرة واحدة وقد تم تحديد الطفرات الشتلات تحمل المطلوب ، واستعادة هذه المادة من لوحات الآيس كاب ونقل إلى التربة. وليس المقصود iTILLING لتوفير السكان طويلة الأمد متحولة لمجتمع البحوث بأكمله إلى الشاشة. بدلا من ذلك ، يوفر استراتيجية iTILLING التييمكن للمرء أن عدد سكان العالم شاشة مخصصة متحولة عن طفرات في حفنة من الجينات بسرعة وكفاءة ، وبتكلفة منخفضة نسبيا.
لقد تم العثور على الجليد رسملة لتكون وسيلة فعالة للنمو والتنميط الجيني Arabidopsis ، والبندورة ، والأرز. نتوقع أن الأنواع الأخرى من النباتات وينبغي أيضا أن تكون قابلة للكاب الجليد. أحد قيود على مجموعة متنوعة من الأنواع التي يمكن استيعابها من قبل الآيس كاب هو حجم البذور. وسوف النباتات فقط مع بذور صغيرة بما يكفي لتناسب آبار لوحة 96 – جيدا تكون متوافقة مع كاب الجليد في التكوين الحالي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل بواسطة منحة من مؤسسة العلوم الوطنية (منح عدد MCB – 0447750).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
| ABgene Thermo-Sealer | ABgene USA | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
| Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
| MicroFill Microplate Dispenser | BioTek www.biotek.com |
AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
| Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
| Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
| 33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet |
| 30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
| Hose for fountain pump | Any lab supply company | Hose compatible with fountain pump | |
| Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
| Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Falcon www.bdbiosciences.com |
351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| 3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
| 3 inch Elastic hair bands | Local grocery store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
| 4 mm diameter wooden skewers | Local grocery store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
| Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
| Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
| Agar – cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
| Easy Peel heat sealing foil | ABgene USA | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
| Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd | OfficeMax www.officemax.com |
Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
| Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
| 96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
| Whatman Filter paper | Whatman International | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
| Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. |
References
- Clark, K. A., Krysan, P. J. Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0). Plant Methods. 3, 8-8 (2007).
- Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis. Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).
- Jander, G. Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).
- Liljegren, S. J. SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis. Nature. 404, 766-770 (2000).
- Buechel, S. Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration. Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).
- Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis. Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery. Plant J. 45, 684-694 (2006).
- Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).
Cite This Article
Su, S., Clark, K. A., Gibbs, N. M., Bush, S. M., Krysan, P. J. Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping. J. Vis. Exp. (57), e3280, doi:10.3791/3280 (2011).