Ice-Cap: Un metodo per la Crescita Arabidopsis E piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di High-Throughput Genotipizzazione

1. Preparare Ice-Cap Piastre Seedling con Media crescita Agar Terreni di crescita fuso (0.5X Murashige e Skoog (MS), miscela di sale basale, 2 mM Morpholinoethanesulfonic acido (MES), 0,6% agar (w / v), pH 5,7) è erogato in Piastre Seedling autoclave utilizzando un Dispenser per micropiastre Microfill. Un litro di media è necessario per ogni 18 Targhette semenzale. Preparare i media di crescita in un litro bottiglie di vetro con coperchio a vite superiore e autoclave per 20 minuti. Autoclave un litro di acqua distillata in una bottiglia di vetro con coperchio a vite superiore. Allo stesso tempo, anche in autoclave Piastre Seedling vuoto avvolti in carta stagnola. Trasferire i media in autoclave e l'acqua ad un incubatore a 65 ° C. Questa temperatura manterrà i mezzi di crescita allo stato fuso. Dopo la sterilizzazione in autoclave, togliere piastre Seedling da pellicola e mettere in cappa a flusso laminare ad asciugare. Piastre deve essere completamente asciutto prima di procedere in modo che il nastro adesivo puòcompletamente sigillare i fori sul fondo dei pozzetti delle piastre. Pulire banco di laboratorio con il 95% di etanolo per igienizzare. Mettere a bagno i coperchi in plastica trasparente per le tavole Seedling in etanolo al 95% per igienizzare. Rimuovere i coperchi da etanolo e aria secca nella cappa a flusso laminare. Non sterilizzare in autoclave i coperchi di plastica per sterilizzarli, perché si sciolgono in autoclave. Applicare il nastro di imballaggio per il fondo di ogni piatto piantine e saldamente tenuta utilizzando lo strumento a rullo. Mettere le bottiglie di terreni di crescita fuso e acqua sterilizzata a bagnomaria insieme a 65 ° C. Allegare una bottiglia contenente etanolo al 70% a temperatura ambiente per la macchina Microfill ed eseguire il ciclo di spurgo due volte per sanificare l'impianto idraulico della macchina Microfill. Fissare la bottiglia con acqua sterile alla macchina Microfill. Eseguire il ciclo di spurgo sei volte per scaldare l'impianto idraulico e chiaro l'etanolo dal sistema. La bottiglia di acqua dovrebbe rimanere nel bagno a 65 ° C durante tutta la procedura. Dopo aver completato le purghe con acqua sterile, subito attaccare la bottiglia di terreni di crescita fuso alla macchina Microfill. Eseguire il ciclo di spurgo due volte per eliminare l'acqua distillata fuori l'impianto idraulico. La bottiglia di terreni di crescita dovrebbe rimanere in bagno a 65 ° C durante tutta la procedura. Dispensare 450 microlitri di terreni di crescita nei pozzetti di ogni piastra Germogli. Lavorare velocemente in modo che i mezzi di crescita non si solidifichi nell'impianto idraulico della macchina Microfill. Quando tutte le piastre piantine sono state riempite, subito attaccare la bottiglia di 65 ° C acqua sterile per la macchina Microfill ed eseguire il ciclo di spurgo 12 volte per pulire l'impianto idraulico. La bottiglia di acqua dovrebbe rimanere nel bagno a 65 ° C durante tutta la procedura. Se una macchina Microfill non è disponibile, Piatti Seedling può anche essere preparato a mano pipettaggio agar fuso nelle piastre sigillato con una pipetta multicanale. Controllare i pozzi di ogni t piantine Piastreo garantire che i mezzi di crescita non è trapelato fuori di ogni pozzi. Mano pipetta supporti aggiuntivi crescita fuso in pozzi individuali se necessario. Coprire ogni piatto con un coperchio di plastica trasparente, e consente alla carta la crescita per solidificare nelle piastre Seedling a temperatura ambiente. Piastre di stack e avvolgerlo in un foglio di alluminio per la conservazione a 4 ° C. Conservare le piastre a testa in giù per evitare l'accumulo di acqua nei pozzi durante la conservazione. 2. Seminare in Ice-Cap Piastre piantine e piantine Germinate Abbiamo già descritto un metodo semi-automatico per il dosaggio semi di Arabidopsis in Piastre Seedling utilizzando un dispositivo di carico di semi (2). Anche se questo dispositivo può essere utile per alcuni lotti di seme, abbiamo trovato che la variabilità di dimensioni semi visualizzati da diversi lotti di semi di Arabidopsis limita l'utilità generale di questo dispositivo. Siamo nel processo di sviluppo di un metodo alternativo per i semi automatico di erogazione, but al momento abbiamo trovato che la strategia più efficace per l'erogazione di semi nelle piastre semenzale è quello di eseguire questa operazione a mano come descritto di seguito. Cospargere semi secchi su carta Whatman filtro. Dispensare 95% di etanolo su semi in modo che tutti i semi sono coperti con etanolo. Questo trattamento superficiale sterilizzare i semi. Lasciare i semi asciugare all'aria. Trasferimento semi individuali nei pozzetti delle piastre Germogli utilizzando una versione modificata e getta pipetta Pasteur di vetro. La fine della pipetta Pasteur è sigillata mediante esposizione alla fiamma della punta. La punta di vetro che ne risulta è inumidito da sfiorando ai media agar, che consente a un singolo seme per essere facilmente raccolti e trasferiti alla superficie l'agar nei pozzetti della piastra Germogli. A due teste versione di questo strumento placcatura seme può essere utilizzato anche per aumentare il throughput. Coprire ogni piastra Seedling con un coperchio di plastica trasparente e sigillare con nastro Micropore chirurgico. Avvolgere i piatti impilaticon foglio di alluminio e semi di Arabidopsis conservare a 4 ° C per quattro giorni per stratificare i semi e sincronizzare la germinazione. Semi di pomodoro deve essere conservato al buio a 12 ° C per quattro giorni. Posizionare le piastre semenzale sotto una luce fluorescente a 18 ° a 20 ° C per iniziare la germinazione. 3. Trasferimento Piastre Seedling di Ice-Cap Fontana Dopo le piastre Seedling sono stati in presenza di luce per quattro giorni, il trasferimento Piastre Seedling per l'Ice-Cap fontana. Per Arabidopsis, le piante sono tipicamente lasciato nella fontana di ghiaccio Cap per 10 a 14 giorni. Assemblare la calotta di ghiaccio Fontana mettendo uno strato di biscotto in cima alla struttura a rack personalizzato che è stato collocato all'interno di una scatola di plastica. Utilizzare i dadi di livellamento per regolare il livello del foglio cookie. Inserire una pompa sommersa nel contenitore e collegare il tubo di uscita dalla pompa al lato della teglia con una molla clamp. Assemblare la calotta di ghiaccio Fontana su uno scaffale nella sala crescita delle piante o camera di crescita in modo che la superficie del ghiaccio-Cap Fontana riceve direttamente lampade fluorescenti. Riempire il ghiaccio-Cap Fontana con una miscela di 3 parti di acqua distillata per 1 parte di acqua di rubinetto. L'acqua deve essere aggiunto alla fontana fino a quando la pompa sommersa è diversi centimetri sotto il livello dell'acqua. Segna l'ultimo livello dell'acqua nel contenitore di plastica con del nastro da laboratorio e un pennarello. Preparare piatti Root aggiungendo uno 3/32-inch sfera in acciaio inox del diametro di ciascun pozzetto di una piastra Root. Le sfere in acciaio inossidabile può essere aggiunto alla radice piastre usando un custom made ​​palla dispositivo di erogazione 1. Questo dispositivo è fatto mettendo un singolo foglio di alluminio sulla superficie di una piastra a 96 pozzetti PCR ed usando un pennarello per segnare la posizione dei centri di ogni bene sulla superficie della lamina. Questo foglio segnato di lamina viene posto sulla cima di un ulteriore 6 fogli di alluminio peril e avvolto attorno alla superficie liscia di un coperchio di una scatola di punta della pipetta usata. Uno strumento affilato come uno spiedino di legno viene poi utilizzato per creare una zolla abbastanza grande da contenere una singola sfera di metallo in ciascuna delle 96 posizioni. Per riempire questo dispositivo di erogazione con le palle, un eccesso di sfere di metallo viene versato sul dispositivo ed è delicatamente scosso per rimuovere le palle in eccesso. La piastra di Root viene posto sopra la parte superiore del dispositivo di erogazione, che è capovolto far cadere una palla in ciascun pozzetto della piastra Root. Aggiungere 340 microlitri di una miscela di 3 parti di acqua distillata e 1 parte di acqua di rubinetto per ciascun pozzetto della piastra Root utilizzare la macchina Microfill. Assicurarsi che le palle d'acciaio sono state aggiunte al Root piastre prima di dispensare l'acqua. Sbucciare la pellicola adesiva dal fondo dei piatti piantine e rimuovere i coperchi di plastica trasparente dalle piastre. Mettete ogni piastra Seedling in un piatto contenente Root una sfera di metallo e l'acqua e sicuro le due piastre insieme utilizzando due hai elasticor bande. Posizionare il impilati Ice-Cap piastre in ghiaccio-Cap Fontana. I coperchi di plastica trasparente non deve essere utilizzato quando le piastre sono in Ice-Cap Fontana. Verificare che sia A-01 della Piastra Germogli è ben allineato con A-01 della Piastra Root. Il impilati Seedling / Root piastre devono essere lasciati nel ghiaccio-Cap Fontana fino alla maggior parte delle piantine hanno tessuto radice che è penetrato nelle piastre Root. La temperatura ideale per la crescita piantine di Arabidopsis nel ghiaccio-Cap Fontana è ca. 18 ° C. Il livello dell'acqua nella teglia deve essere tale che l'acqua può fluire nei pozzetti delle piastre Root, ma non così profonde che le piantine nel piatto Germogli sono sommersi. Se il livello dell'acqua non è corretto è necessario per ottenere un foglio diverso cookie la corretta profondità. Aggiungere acqua distillata periodicamente al Ice-Cap Fontana per mantenere il livello originale dell'acqua. Con l'aggiunta di pura acqua distillata alla fontana si sostituisce illiquidi persi a causa di evaporazione senza cambiare la composizione minerale dell'acqua nella fontana. Livello dell'acqua dovrebbe essere controllato ogni giorno nel ghiaccio-Cap Fontana. 4. Harvest Root Tissue Tessuto radice viene raccolta dal congelamento dell'acqua nel piatto radice e poi peeling della piastra Seedling lontano dalla piastra Root. Il giorno prima della raccolta del tessuto radice, rimuovere il impilati Ice-Cap Piatti dal ghiaccio-Cap Fontana. Inserire tre spiedini di legno tra i pozzi della piantina e piatti impilati Root. Lo scopo del spiedini è quello di aumentare i pennini dei piatti Germogli dalle fonti delle piastre Root in preparazione per il processo di congelamento. Lasciare che il impilati Ice-Cap Piastre con spiedini di legno inserita riposare per una notte sotto le luci. Questo incubazione consente l'evaporazione del liquido leggero nei piatti Root, che facilita il congelamento e la successiva separazione dei processi piatto. Suil giorno di raccolta dei tessuti, preparare un bagno di congelamento. Posizionare un 96-e blocco termico in metallo in una pirofila con una miscela di ghiaccio secco e il 95% di etanolo. Lasciare che il blocco termico per equilibrare la temperatura di ca. 20 minuti. Collocare la pirofila in cima ad un certo tipo di materiale isolante, come un'autoclave guanto modo che la temperatura bassa non danneggia la superficie del banco di laboratorio. Posizionare il impilati Ice-Cap piatti con gli spiedini di legno nel blocco termico raffreddato e incubare per 5 minuti. Durante questo periodo l'acqua nella piastra Root si blocca solido. Le piantine nella piastra Germogli non congelare durante questo trattamento e restano pienamente efficiente. Rimuovere il impilati Ice-Cap piatti dal blocco termico e metterli sul banco di laboratorio a temperatura ambiente. Rimuovere le fasce elastiche e gli spiedini di legno dalle piastre sovrapposte. Premere con forza sulla parte superiore della piastra Germogli di "crack" delle piastre. Poi accuratamente buccia la Targa Radice e la piastra di Seedling aparte. Lasciare l'acqua nel Piastre Root per scongelare a temperatura ambiente. Scongelamento può essere accelerata tramite l'incubazione del Piastre Root in un blocco termico a 25 ° C. 5. Conservare Piastra Seedling a bassa temperatura in the Dark A seguito di raccolta dei tessuti, le piastre piantina può essere conservato al buio a bassa temperatura che mantiene la vitalità delle piantine, mentre l'analisi del genotipo viene eseguita. Le piantine possono essere conservati a queste temperature per diverse settimane senza intaccare la vitalità. A seguito di raccolta dei tessuti, sigillare la parte inferiore della piastra piantina con nastro adesivo. Mettere un coperchio di plastica trasparente sulla parte superiore della piastra di piantine e fissarlo con nastro microforato. Stack Piastre Seedling insieme diversi e avvolgerlo in un foglio di alluminio. Per le piantine di Arabidopsis, collocare le piastre a 4 ° C. Per le piantine di pomodoro, posizionare le piastre a 12 ° C. Una volta genotipizzazione è completa, la SEedlings può essere rimosso da questa incubazione a bassa temperatura e trapiantato al suolo come descritto di seguito. 6. Estrazione del DNA DNA adatto per reazioni di PCR può essere facilmente estratto da campioni di tessuto alla radice. La resa del DNA totale recuperato da campioni di tessuto Arabidopsis radice è ca. 400 ng in media 2. Assicurarsi che l'acqua nei piatti Root ha completamente scongelati prima di eseguire la procedura di estrazione del DNA. Esaminare le piastre per determinare se i pozzi d'acqua hanno notevolmente inferiore rispetto alla media. Pipetta a mano acqua distillata in pozzi che richiedono acqua supplementare. Utilizzare la macchina Microfill per aggiungere 25 microlitri di una soluzione Tris-EDTA (500 mM Tris, pH 8, 50 mM EDTA, pH8) in ciascun pozzetto della Piastre Root. Sigillare i pozzetti del Piastre Root con lamina di tenuta termica e una macchina per saldatura a caldo. Posizionare le piastre radice sigillata sulla macchina GenoGrinder con ilfine sigillata delle piastre rivolto verso il basso. Questo orientamento piastra fornisce ottimale movimento tallone e previene le perle si attacchino nei pozzetti. Agitare le piastre in GenoGrinder per 3 minuti e mezzo a 1350 colpi al minuto. Trasferire le piastre di una centrifuga con supporti per micropiastre e far girare le piastre per 10 minuti a 3500 rpm a 4 ° C per far sedimentare il tessuto radice polverizzata. L'estratto risulta diluita contiene DNA genomico che possono essere direttamente utilizzati nelle reazioni PCR. Tipicamente si aggiungerà 2 microlitri di questo estratto il DNA ad una reazione PCR. Per la conservazione di campioni di DNA, sigillare la micropiastra utilizzando nastro adesivo di imballaggio e posto a meno 20 ° C. Campioni di DNA possono essere conservati per diversi mesi senza apparente riduzione della qualità. 7. Trasferimento piantine con genotipo desiderato per il suolo Una volta che l'analisi del genotipo è completa, piantine con il genotipo desiderato può essere trasferita dal SeedlingPiastre al suolo. Rimuovere le piastre Germogli di celle frigorifere e preparare vasetti con acqua satura di miscela suolo. Per rimuovere una pianticella individuo dalla piastra semenzale, usare una pinza che permette di afferrare il tappo di agar senza schiacciare la piantina. Afferra la spina agar con la pinza e far scorrere la spina agar dalla piastra Germogli facendo attenzione a non danneggiare le piantine. In alternativa, la pressione atmosferica può essere usata per sparare delicatamente il tappo di agar e piantina fuori dal pozzo. Applicare una pressione al piccolo foro nel fondo del pozzo fino a quando il tappo salta fuori sul banco di laboratorio. Preparare un piccolo foro nel terreno le dimensioni della spina agar. Posizionare la spina agar nel suolo e pacco terreno umido attorno alla spina agar per fissare la piantina nel terreno. Non tentare di rimuovere i agar provenienti da tutto il germoglio. Mettere le piantine trapiantate in una camera di crescita in condizioni standard di crescita. Coprire la pentola con un coperchio di plastica per ilprimi due giorni dopo il trapianto. Successivamente rimuovere il coperchio e continuare a crescere le piante con condizioni standard. 8. Rappresentante dei risultati: Un esempio di piantine di Arabidopsis coltivato con l'Ice-Cap sistema è mostrato in Figura 4A. Queste piantine erano state nel ghiaccio-Cap fontana per due settimane quando la foto è stata scattata ed erano pronti per la raccolta dei tessuti. Tessuto radice di queste piantine è presentato nella Figura 4B. La quantità totale di DNA estratto da un campione di tessuto radice di Arabidopsis è tipicamente nel range di 100 ng e 700 ng 2. Questo calcolo rendimento è basato sull'uso di una sola porzione di estratto di radice di greggio. Perché solo ca. 10% del greggio estratto di radice è tipicamente usato per il processo di estrazione del DNA, è possibile ottenere DNA significativamente più genomico per l'analisi a valle, conservando più del greggio estratto. La quantità totale di DNA genomico ottenuti utilizzando il ghiaccioProcedura di Cap è sufficiente per eseguire centinaia di reazioni PCR 2. Figura 1: Diagramma di flusso del processo di Ice-Cap. A) Piastra Seedling contenenti terreni di coltura agar su cui germinano piantine. Le radici penetrano l'agar e crescere verso il fondo del piatto. Fori nel fondo dei pozzetti della piastra sono sigillati con pellicola adesiva. B) La piastra Seedling è accatastato sulla cima di una piastra Radice contenente acqua e una pallina di metallo. Radici uscire i fori nel fondo dei pozzetti della piastra piantine e crescere nei pozzetti della piastra Root. C) spiedini di legno vengono inseriti tra la piastra Seedling e la piastra di Root il giorno prima della Cap accatastate lastre di ghiaccio si trovano in una Termoblocco in ghiaccio secco / etanolo da bagno. D) Una volta l'acqua nella piastra Root ha congelato solido, la piastra Seedling è staccato dalla piastra Root, ottenendo una piastra Radice con 96 campioni di tessutoe un piatto Seedling con 96 piantine vitali. Gli spiedini di legno facilitare la separazione delle due piastre in questa fase. Figura 2: Le fotografie di una piastra piantine e un piatto Root. A) Un piatto Seedling e una piastra Root visto separatamente. B) una piastra Seedling accatastati in cima a una piastra Root. Le sfere in acciaio utilizzate per l'estrazione del DNA può essere visto nei pozzetti della piastra Root. Elastici vengono utilizzati per fissare le due piastre insieme. Figura 3: The Ice-Cap Fontana. La calotta di ghiaccio Fontana viene utilizzato per mantenere costante il livello dell'acqua all'altezza precisa delle cime dei pozzi delle piastre Root. Questo sistema di irrigazione continuo assicura che l'acqua nei pozzi delle lastre root non si esauriscono a causa di evaporazione o traspirazione. A) fatto in casa su rackche sostiene la teglia su cui la impilati Ice-Cap Piastre sedersi. B) Una vista ravvicinata di uno dei 1 "dadi che fornisce un mezzo per la precisione il livello della teglia in modo che una profondità d'acqua uniforme si ottiene attraverso la superficie della fontana. C) Questa immagine mostra tutti i componenti necessari per costruire fatti in casa rack per un Ice-Cap Fontana. D) Il assemblato Ice-Cap Fontana. Una pompa fontana sommergibile si muove costantemente l'acqua dal serbatoio inferiore al foglio di cookie, che poggia sulla parte superiore del fatto in casa rack. Un morsetto a molla è utilizzato per collegare il tubo al bordo della teglia. Figura 4: piantine di Arabidopsis coltivato con l'Ice-Cap processo. A) Vista dall'alto guardando verso il basso in due pozzetti di una piastra Germogli. Ciascun pozzetto contiene una piantina Arabidopsis. B) Vista laterale di due pozzetti di una piastra Root. Le radici possono essere visti torsioneattorno alla superficie interna dei pozzetti. Le piantine in questo quadro era stato nel ghiaccio-Cap Fontana per ca. due settimane e sono in fase di crescita in cui raccogliere il tessuto normalmente essere eseguita.