Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung
Summary
Die Ice-Cap-Verfahren erlaubt es, Pflanzen in 96-Well-Platten und zerstörungsfrei Ernte Wurzelgewebe von jedem Sämling wachsen. DNA von dieser Wurzel Gewebe extrahiert werden können für die Genotypisierung Reaktionen eingesetzt werden. Wir haben festgestellt, dass Ice-Cap gut für<em> Arabidopsis thaliana</em>, Tomaten und Reis Sämlinge.
Abstract
Es wird immer für den Anlagenbau Wissenschaftler gemeinsam Projekte, die die Genotypisierung einer großen Zahl von Anlagen erfordern entwickeln. Der erste Schritt in eine Genotypisierung Projektes ist es, eine Gewebeprobe aus einzelnen Pflanzen zu sammeln. Der traditionelle Ansatz, um diese Aufgabe ist es, Probe Pflanzen one-at-a-time. Will man Genotyp Hunderte oder Tausende von Einzelpersonen, aber mit dieser Strategie führt zu einer deutlichen Engpass bei der Genotypisierung Pipeline. Die Ice-Cap-Methode, die wir hier beschreiben, ist ein High-Throughput-Lösung für diese Herausforderung, indem ein Wissenschaftler, um Gewebe aus mehreren tausend Sämlinge an einem einzigen Tag 1,2 sammeln. Dieses Maß an Durchsatz wird durch die Tatsache, dass Gewebe aus Pflanzen ist 96-at-a-time geerntet, sondern als ein-at-a-time.
Die Ice-Cap-Verfahren stellt eine integrierte Plattform für die Durchführung Sämlingwachstum-, Gewebe-Ernte, und die DNA-Extraktion. Die Grundlage für die Ice-Cap ist das Wachstum der seedlings in einem gestapelten Paar von 96-Well-Platten. Die Brunnen der oberen Platte enthalten Stecker von Agar Nährmedien, auf denen einzelne Sämlinge keimen. Die Wurzeln wachsen nach unten durch den Agar-Medien, beenden Sie das obere Platte durch ein Loch, und gelangen in eine untere Platte mit Wasser. Zur Ernte Gewebe zur DNA-Extraktion, das Wasser in der unteren Platte, die Wurzel Gewebe schnell eingefroren, solange die Keimlinge in der oberen Platte bei Raumtemperatur bleiben. Die obere Platte wird dann von der unteren Platte, geschält Nachgeben einer Platte mit 96 root Gewebeproben in Eis und eine Platte mit 96 lebensfähige Sämlinge eingefroren. Die Technik trägt den Namen "Ice-Cap", weil es Eis verwendet, um die Wurzel Gewebe zu erfassen. Der 96-Well-Platte mit den Setzlingen kann dann in Folie verpackt und auf niedriger Temperatur. Dieser Prozess setzt ein weiteres Wachstum der Sämlinge, aber keinen Einfluss auf ihre Lebensfähigkeit. Nach Analyse des Genotyps abgeschlossen ist, können Sämlinge mit den gewünschten Genotyp aus dem 96-Loch-p übertragen werdenspät, um Boden für die weitere Vermehrung. Wir haben den Nutzen des Ice-Cap-Verfahren mit Arabidopsis thaliana, Tomaten und Reis Sämlinge unter Beweis gestellt. Wir erwarten, dass die Methode sollte auch für andere Arten von Pflanzen mit Samen klein genug, um in die Vertiefungen von 96-Well-Platten passen.
Protocol
1. Bereiten Sie Ice-Cap Sämling Platten mit Agar Nährmedien Molten Nährmedien (0.5X Murashige und Skoog (MS) basalen Salzmischung, 2 mM Morpholinethansulfonsäure (MES), 0,6% Agar (w / v), pH 5,7) wird in autoklaviert Sämling Platten mit einem MICROFILL Microplate Dispenser entfallen. Ein Liter Medium pro 18 Sämling Platten benötigt werden. Bereiten Nährmedien in einem Liter Glasflaschen mit Schraubverschluss Deckel und Autoklaven für 20 Minuten. Autoclave einem Liter destilliertes Wasser in einer Glasflasche mit Schraubdeckel. Zur gleichen Zeit auch Autoklaven leer Sämling Plates in Aluminiumfolie eingewickelt. Übertragen Sie die autoklaviert Medien und Wasser in einen Inkubator eingestellt bei 65 ° C. Diese Temperatur wird weiterhin das Wachstum Medien in einem geschmolzenen Zustand. Nach dem Autoklavieren entfernen Sämling Platten aus Folie und in Laminarströmungshaube zu trocknen. Die Platten müssen absolut trocken sein, bevor Sie fortfahren, damit der Kleber Klebeband kannvollständig zu verschließen die Löcher auf der Unterseite die Vertiefungen der Platten. Wischen Sie Labortisch mit 95% Ethanol zu desinfizieren. Soak klaren Kunststoffdeckel für den Sämling Platten in 95% Ethanol zu desinfizieren. Entfernen Sie Deckel aus Ethanol und an der Luft trocknen in Laminarströmungshaube. Nicht autoklavieren die Plastikdeckel, um sie zu sterilisieren, da sie in den Autoklav schmelzen. Übernehmen Klebeband an der Unterseite eines jeden Setzling Plate und fest Dichtung mit der Walze Werkzeug. Legen Sie die Flaschen aus geschmolzenem Nährmedien und sterilem Wasser in einem Wasserbad bei 65 ° C eingestellt Bringen Sie eine Flasche mit 70% Ethanol bei Raumtemperatur auf die MICROFILL Maschine und führen Sie den Spülzyklus zwei Mal, um die Leitungen der MICROFILL Maschine desinfizieren. Bringen Sie die Flasche mit sterilem Wasser auf die MICROFILL Maschine. Führen Sie den Spülzyklus sechsmal um die Sanitär-warm und klar das Ethanol aus dem System. Die Flasche Wasser sollte in der 65 ° C-Bad in diesem Verfahren bleiben. Nach Abschluss der Säuberungen mit sterilem Wasser, sofort legen die Flasche aus geschmolzenem Nährmedien, die MICROFILL Maschine. Führen Sie den Spülzyklus zwei Mal, um das destillierte Wasser aus den Leitungen zu löschen. Die Flasche des Wachstums Medien sollten in der 65 ° C-Bad während des gesamten Verfahrens bleiben. Dispense 450 Mikroliter der Nährmedien in die Vertiefungen eines jeden Setzling Plate. Arbeiten Sie schnell, so dass das Wachstum Medien nicht in die Röhren der MICROFILL Maschine zu festigen. Wenn alle Sämling Platten gefüllt wurden, sofort legen die Flasche von 65 ° C sterilem Wasser auf die MICROFILL Maschine und führen Sie den Spülzyklus 12 Mal um die Sanitär-clean. Die Flasche Wasser sollte in der 65 ° C-Bad während des gesamten Verfahrens bleiben. Wenn ein MICROFILL Maschine nicht verfügbar ist, können Sämling Platten auch von Hand-Pipettieren geschmolzenem Agar in den versiegelten Platten mit einer Mehrkanalpipette vorbereitet werden. Überprüfen Sie die Vertiefungen jeder Setzling Plates to sicherzustellen, dass das Wachstum Medien nicht aus einem Brunnen durchgesickert. Handpipette zusätzlichen geschmolzenen Nährmedien in einzelnen Vertiefungen nach Bedarf. Cover jede Platte mit einem klaren Kunststoff-Deckel und lassen Nährmedien in den Sämling Platten bei Raumtemperatur erstarren. Stellen Sie Teller und in Alufolie wickeln für die Lagerung bei 4 ° C. Shop-Platten auf den Kopf, um die Ansammlung von Wasser in den Brunnen zu verhindern während der Lagerung. 2. Aussaat der Samen in Ice-Cap Sämling Plates und keimen Jungpflanzen Wir haben bereits ein halbautomatisches Verfahren zur Abgabe von Arabidopsis Samen in Sämling Platten mit einer Seed-Ladevorrichtung (2) beschrieben. Obwohl dieses Gerät kann für einige Chargen von Samen nützlich, haben wir festgestellt, dass die Variabilität in Größe der Samen von verschiedenen Chargen von Arabidopsis Samen zeigten die allgemeine Nützlichkeit dieses Gerätes Grenzen. Wir befinden uns im Prozess der Entwicklung einer alternativen automatisierte Methode für Saatgut Dosieren, but Zur Zeit haben wir festgestellt, dass die effektivste Strategie zur Abgabe von Samen in den Sämling Plates zu diesem Schritt von Hand durchführen, wie unten beschrieben ist. Sprinkle trockenen Samen auf Whatman-Filterpapier. Dispense 95% Ethanol auf Samen, so dass alle die Samen mit Ethanol abgedeckt werden. Diese Behandlung wird an die Oberfläche zu sterilisieren die Samen. Lassen Samen an der Luft trocknen. Transfer einzelnen Samen in die Vertiefungen der Platten Sämling mit einer modifizierten Einwegglasteile Pasteurpipette. Das Ende der Pasteurpipette wird durch Abflammen der Spitze versiegelt. Die daraus resultierende Glas Spitze wird durch leichtes Berühren der Agar-Medien, die eine einzelne Samen einfach abgeholt werden und an die Oberfläche des Agars in die Vertiefungen der Platte ermöglicht Sämling befeuchtet. Ein Doppelpfeil Version dieses Saatgut Plating-Tool kann auch verwendet werden, um den Durchsatz zu erhöhen. Cover jede Sämling Platte mit einem klaren Kunststoff-Deckel und Dichtung mit Micropore chirurgischen Band. Wickeln Sie die gestapelten Plattenmit Alu-Folie und speichern Arabidopsis Samen bei 4 ° C für vier Tage zur Schichtung der Samen und synchronisieren Keimung. Tomatensamen sollten im Dunkeln bei 12 ° C für 4 Tage gespeichert. Setzen Sie den Setzling Platten unter Fluoreszenzlicht bei 18 ° bis 20 ° C zur Keimung einzuleiten. 3. Transfer-Sämling Plates zu Ice-Cap-Brunnen Nach dem Keimling-Platten unter Licht für vier Tage gewesen sein, überweisen Sie den Setzling Plates um die Ice-Cap Brunnen. Für Arabidopsis werden die Keimlinge in der Regel in der Ice Cap Brunnen für 10 bis 14 Tage. Montieren Sie die Ice-Cap-Brunnen, indem Sie ein Backblech auf der Oberseite des rack-Struktur, die in einem Kunststoff-Aufbewahrungsbox gelegt wurde. Verwenden Sie die Nivellierung Muttern auf das Niveau des Backblech stellen. Legen Sie eine Tauchpumpe in der Aufbewahrungsbox und befestigen Sie den Ausgang Schlauch von der Pumpe auf die Seite des Backblech mit einem federbelasteten clamp. Montieren Sie die Ice-Cap-Brunnen auf einem Regal in der Pflanzenwachstum Zimmer oder Klimakammer, so dass die Oberfläche des Eis-Cap-Brunnen erhält direkte Neonbeleuchtung. Füllen Sie den Ice-Cap-Brunnen mit einer Mischung aus 3 Teilen destilliertem Wasser zu 1 Teil Leitungswasser. Das Wasser sollte zum Brunnen hinzugefügt werden, bis die Tauchpumpe ist einige Zentimeter unterhalb des Wasserspiegels. Mark die endgültige Wasserstand in der Kunststoff-Aufbewahrungsbox mit Labor-Band und ein Markierstift. Bereiten Sie Root-Platten durch Zugabe von einem 3/32-inch Durchmesser Kugel aus Edelstahl in jede Vertiefung einer Root-Plate. Die Edelstahl-Kugeln um die Root-Platten mit einem speziell angefertigten Ball Abgabevorrichtung 1 hinzugefügt werden. Dieses Gerät wird hergestellt, indem ein einzelnes Blatt aus Aluminiumfolie auf der Oberfläche einer 96-well PCR-Platte und mit einem Filzstift auf die Standorte der Zentren der einzelnen Vertiefungen auf der Oberfläche der Folie einen Namen gemacht. Dies markierte Blatt Folie wird dann oben auf weitere 6 Bleche aus Aluminium für angebrachtil und rund um die glatte Oberfläche eines Deckels aus einer gebrauchten Pipettenspitze Box verpackt. Ein spitzes Werkzeug wie einem Holzstäbchen wird dann verwendet, um eine Kerbe groß genug, um ein einzelnes Metall Kugel an jedem der 96 Positionen halten zu schaffen. Um diese Lücke zu Ausgabevorrichtung mit Bällen, ist ein Überschuss von Metallkugeln über das Gerät gegossen, und es ist leicht geschüttelt, um überschüssige Kugeln zu entfernen. Die Root-Platte wird dann über die Spitze der Ausgabevorrichtung, die umgedreht ist es, eine Kugel in jedes Well der Root-Platte Drop platziert. Add 340 Mikroliter einer Mischung aus 3 Teilen destilliertem Wasser zu 1 Teil Leitungswasser in jede Vertiefung der Root-Platte mit dem MICROFILL Maschine. Stellen Sie sicher, dass die Stahlkugeln auf die Root-Platten wurden vor der Abgabe des Wassers aufgenommen. Ziehen Sie die Klebefolie von der Unterseite der Sämling Plates und entfernen Sie die durchsichtige Plastik-Deckel von den Platten. Setzen Sie jeden Setzling Plate in einer Root-Platte mit einer Metallkugel und Wasser und sichere die beiden Platten zusammen mit zwei elastischen hair Bands. Legen Sie die gestapelten Ice-Cap-Platten in der Ice-Cap-Brunnen. Die klare Kunststoffdeckel sollte nicht verwendet werden, wenn die Platten in der Ice-Cap-Brunnen werden. Vergewissern Sie sich, dass auch A-01 der Sämling Platte mit gut A-01 von der Root-Platte ausgerichtet ist. Die gestapelten Sämling / Root-Platten sollten in der Ice-Cap-Brunnen belassen werden, bis die Mehrheit der Sämlinge Wurzel Gewebe, in das Root-Platten eingedrungen ist zu haben. Die ideale Temperatur für das Wachstum Arabidopsis-Keimlinge in der Ice-Cap-Brunnen ist ca. 18 ° C. Der Wasserstand in dem Backblech sollte so sein, dass Wasser in die Vertiefungen des Root-Platten fließen, aber nicht so tief, dass die Keimlinge in der Sämling Platte untergetaucht sind. Wenn der Wasserstand nicht korrekt ist, müssen Sie ein anderes Cookie Blatt die richtige Tiefe zu bekommen. Fügen Sie destilliertes Wasser in regelmäßigen Abständen, um die Ice-Cap-Brunnen, um das ursprüngliche Wasser zu halten. Durch die Zugabe von reinem destilliertem Wasser in den Brunnen Sie ersetzen dieFlüssigkeit verloren durch Verdunstung, ohne die mineralische Zusammensetzung des Wassers in den Brunnen. Wasserstand sollte täglich in der Ice-Cap-Brunnen überprüft werden. 4. Ernte Wurzelgewebe Root-Gewebe wird durch Gefrieren des Wassers in der Root-Platte und dann schälen Sämling Platte weg von der Root-Platte geerntet. Der Tag vor der Ernte Wurzelgewebe, entfernen Sie die gestapelten Ice-Cap-Platten aus dem Eis-Cap-Brunnen. Legen Sie drei Holzspieße zwischen den Vertiefungen der gestapelten Sämling und Root-Platten. Der Zweck der Spieße ist es, die Federn der Sämling Platten heben aus dem Brunnen des Root-Platten in Vorbereitung auf das Einfrieren. Lassen Sie die gestapelten Ice-Cap-Platten mit Holzspieße gesteckt über Nacht stehen unter Kunstlicht. Diese Inkubation ermöglicht leichten Verdampfen der Flüssigkeit in das Root-Platten, die die anschließende Einfrieren und Platte Trennverfahren erleichtert. AufTag der Gewebe Ernte, Vorbereitung eines Gefrierbad. Legen Sie eine 96-Well-Metall Thermoblock in einer Pyrex-Schale mit einer Mischung aus Trockeneis und 95% Ethanol. Lassen Sie die thermische Block in Temperatur über ca. Gleichgewicht zu bringen. 20 Minuten. Legen Sie die Pyrex Schüssel oben auf irgendeine Art von Isoliermaterial wie Autoklaven, so dass die niedrigen Temperaturen nicht beschädigt die Oberfläche der Labortisch Fäustling. Legen Sie die gestapelten Ice-Cap-Platten mit dem Holzstäbchen in die gekühlte thermische Block und Inkubation für 5 Minuten. Während dieser Zeit das Wasser in die Root-Platte friert fest. Die Keimlinge in der Sämling Platte nicht während dieser Behandlung einzufrieren und bleiben voll lebensfähig. Entfernen Sie die gestapelten Ice-Cap-Platten aus der thermischen Block und legen Sie sie auf dem Labortisch bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Gummibänder und die Holzspieße aus der gestapelten Platten. Drücken Sie fest auf den oberen Rand des Sämling Platte zu "knacken" die Platten. Dann vorsichtig schälen Wurzelteller und der Keimling Platte apart. Lassen Sie das Wasser in das Root-Platten bei Raumtemperatur auftauen lassen. Das Auftauen kann durch Inkubation der Root-Platten in einem thermischen Block bei 25 ° C eingestellt beschleunigt werden 5. Shop Sämling Platte bei niedriger Temperatur in the Dark Nach Gewebe Ernte kann der Keimling Platten im Dunkeln bei niedriger Temperatur, welche die Lebensfähigkeit der Sämlinge zu erhalten wird, während Genotyp-Analyse durchgeführt wird gespeichert. Die Sämlinge können bei diesen Temperaturen für mehrere Wochen, ohne die Lebensfähigkeit gelagert werden. Nach Gewebe Ernte, Dichtung im unteren Teil des Keimlings Platte mit Klebeband. Legen Sie eine klare Kunststoff-Deckel auf der Oberseite des Sämling Plate und sicher mit Mikroporen Band. Stack mehrere Sämling Platten zusammen und in Alufolie wickeln. Für Arabidopsis-Keimlinge, legen Sie die Platten bei 4 ° C. Für Tomatenjungpflanzen, legen Sie die Platten bei 12 ° C. Nach Genotypisierung abgeschlossen ist, die seedlings kann von dieser niedrigen Temperatur der Inkubation entfernt und transplantiert zu Boden, wie unten beschrieben. 6. DNA-Extraktion DNA für PCR-Reaktionen können leicht von der Wurzel Gewebeproben entnommen werden. Die Ausbeute an Gesamt-DNA aus Arabidopsis root Gewebeproben gewonnen wird ca. 400 ng durchschnittlich 2. Stellen Sie sicher, dass das Wasser in das Root-Platten vollständig, bevor Sie die DNA-Extraktionsverfahren aufgetaut. Überprüfen Sie die Platten um festzustellen, ob Brunnen erheblich weniger Wasser als der Durchschnitt haben. Handpipette destilliertem Wasser in Bohrlöcher, die zusätzliche Wasser benötigen. Verwenden Sie die MICROFILL Maschine bis 25 Mikroliter einer Tris-EDTA-Lösung (500 mM Tris, pH 8, 50 mM EDTA, pH 8) hinzufügen, um jede Vertiefung der Root-Platten. Seal die Vertiefungen der Root-Platten mit thermischen Dichtfolie und Heißsiegelmaschine. Legen Sie die versiegelte root Platten auf dem GenoGrinder Maschine mit demverschlossenen Ende der Platten nach unten. Diese Platte sorgt für eine optimale Orientierung bead Bewegung und verhindert das Anhaften von Perlen in die Vertiefungen geben. Schütteln Sie die Platten in der GenoGrinder für 3 ½ Minuten bei 1350 Hüben pro Minute. Übertragen Sie die Platten auf eine Zentrifuge mit Microplatte Träger und drehen Sie die Platten für 10 Minuten bei 3500 rpm bei 4 ° C zu Pellets der pulverisierten Wurzel Gewebe. Das erhaltene verdünnte Extrakt enthält genomische DNA, die direkt in PCR-Reaktionen verwendet werden kann. Typischerweise wird man 2 Mikroliter dieser DNA zu extrahieren, um eine PCR-Reaktion hinzuzufügen. Für die Lagerung von DNA-Proben, Siegel der Mikrotiterplatte mit Klebstoff Klebeband und Ort bei minus 20 ° C. DNA-Proben können für mehrere Monate ohne sichtbare Qualitätseinbußen gelagert werden. 7. Transfer-Setzlinge mit den gewünschten Genotyp zu Boden Nach Analyse des Genotyps abgeschlossen ist, können Sämlinge mit den gewünschten Genotyp aus dem Keimling übertragen werdenPlatten auf den Boden. Entfernen Sie den Setzling Platten aus Kühlhäusern und bereiten Töpfe mit Wasser gesättigten Boden-Gemisch. Zum Entfernen eines einzelnen Setzling aus dem Keimling Plate, verwenden Sie eine Pinzette, dass man die Agar-Stecker ohne Quetschen der Sämling greifen können. Besorgen Sie sich die Agar-Stecker mit der Zange und schieben Sie die Agar-Stecker aus der Sämling Platte darauf achten, daß der Sämling Schäden. Alternativ kann Druckluft verwendet werden, um sanft schießen die Agar-Plug-and-Sämling aus dem Brunnen sein. Drücken Sie auf das kleine Loch in der Unterseite des Brunnens, bis der Stecker springt heraus auf dem Labortisch. Bereiten Sie ein kleines Loch in den Boden der Größe der Agar-Stecker. Legen Sie die Agar-Stecker in den Boden und packen feuchten Boden rund um den Agar-Stecker an den Keimling in der Erde zu sichern. Versuchen Sie nicht, eine der Agar aus der ganzen Keimling zu entfernen. Legen Sie die transplantierten Sämlinge in einem Wachstumsmarkt Raum unter Standard-Wachstumsbedingungen. Bedecken Sie den Topf mit einem Deckel aus Kunststoff für dieersten beiden Tagen nach der Transplantation. Anschließend den Deckel entfernen und weiterhin die Pflanzen unter Standardbedingungen wachsen. 8. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel für Arabidopsis-Keimlinge gewachsen mit dem Ice-Cap-Systems ist in Abbildung 4A gezeigt. Diese Keimlinge waren in der Ice-Cap Brunnen seit zwei Wochen, wenn das Bild aufgenommen wurde, und waren bereit für die Gewebe-Ernte. Wurzelgewebe aus den gleichen Keimling ist in Abbildung 4B gezeigt. Der Gesamtbetrag der DNA aus einer Probe von Arabidopsis Wurzel Gewebe extrahiert wird in der Regel im Bereich von 100 ng bis 700 ng 2. Diese Ausbeute Berechnung basiert auf der Verwendung von nur einem Teil des Roh-Wurzel-Extrakt basiert. Denn nur ca. 10% des Roh-Wurzel-Extrakt in der Regel ist für die DNA-Extraktion verwendet, ist es möglich, deutlich mehr genomischer DNA für Downstream-Analyse zu erhalten unter Beibehaltung mehrerer der Rohextrakt. Der Gesamtbetrag der genomischen DNA unter Verwendung des Ice-Cap Verfahren ist ausreichend, um Hunderte von PCR-Reaktionen 2 durchzuführen. Abbildung 1: Ablaufschema der Ice-Cap-Prozess. A) Sämling Platte mit Agar-Nährböden, auf denen Sämlinge keimen. Roots dringen in die Agar und wachsen nach unten in Richtung der Unterseite der Platte. Löcher in den Böden der Vertiefungen der Platte werden mit Klebefolie verschlossen. B) Der Sämling Plate ist auf einem Root-Platte mit Wasser und einer Metallkugel gestapelt. Roots Ausfahrt die Löcher in den Böden der Vertiefungen der Sämling Plate und wachsen in die Vertiefungen der Root-Platte. C) Holzspieße zwischen den Sämling Plate und die Root-Platte eingefügt am Tag vor der gestapelten Ice Cap Platten in einem Thermoblock in einem Trockeneis / Ethanol-Bad gestellt werden. D) Wenn das Wasser in die Root-Platte hat gefroren, wird der Sämling Platte weg von der Root-Platte abgezogen, was zu einem Root-Platte mit 96 Gewebeprobenund ein Keimling mit 96 lebensfähige Sämlinge. Die Holzspieße erleichtern die Trennung der beiden Platten bei diesem Schritt. Abbildung 2: Fotos von einem Sämling Plate und eine Root-Plate. A) Ein Sämling Plate und eine Root-Platte gesehen getrennt. B) Ein Sämling Platte auf einem Root-Platte gestapelt. Die Stahlkugeln für die DNA-Extraktion kann in die Vertiefungen der Wurzelteller zu sehen. Elastische Bänder werden benutzt, um die beiden Platten aneinander zu befestigen. Abbildung 3: Die Ice-Cap-Brunnen. Die Ice-Cap-Brunnen wird verwendet, um einen konstanten Wasserstand in der genauen Höhe der Spitzen der Vertiefungen der Root-Platten zu erhalten. Diese kontinuierliche Bewässerung sorgt dafür, dass das Wasser in die Vertiefungen der Wurzel Platten nicht geworden durch Verdunstung oder Transpiration verbraucht. A) Eine hausgemachte RackDas unterstützt das Backblech, auf dem die gestapelten Ice-Cap-Platten sitzen. B) Eine Nahaufnahme eines der 1 "Nüsse, die ein Mittel zur genauen Einstellung der Höhe des Backblech so dass eine gleichmäßige Wassertiefe über der Oberfläche des Brunnens erreicht wird bietet. C) Dieses Bild zeigt alle Teile benötigt, um die hausgemachten Rack für einen Ice-Cap-Brunnen. D) Die versammelten Ice-Cap-Brunnen zu bauen. Eine Tauchpumpe Brunnen Pumpe ständig bewegt Wasser aus dem Unterbecken um das Backblech, die auf der Oberseite des hausgemachten ruht Rack. Eine federbelastete Klammer wird verwendet, um den Schlauch an den Rand des Backblech legen. Abbildung 4: Arabidopsis-Keimlinge gewachsen mit dem Ice-Cap-Prozess. A) Draufsicht schaut in zwei Vertiefungen einer Sämling Plate. Jede Vertiefung enthält einer Arabidopsis Keimling. B) Seitenansicht von zwei Vertiefungen einer Root-Plate. Roots zu sehen Verdrehen werdenum die innere Oberfläche der Vertiefungen. Die Sämlinge in diesem Bild hatte in der Ice-Cap-Brunnen für ca. worden. 2 Wochen und sind in der Wachstumsphase, bei der Gewebe Ernte normalerweise würde durchgeführt.
Discussion
Die Ice-Cap hier vorgestellte Methode ermöglicht ein Wissenschaftler an Gewebeproben von Hunderten oder sogar Tausenden von einzelnen Pflanzen an einem einzigen Tag zu sammeln und effizient zu extrahieren genomischer DNA aus den Proben für den Einsatz in Genotypisierung Reaktionen. Durch die Aufgabe von einzelnen Wissenschaftler die Möglichkeit, Tausende von Setzlingen in einem kurzen Zeitraum Genotyp hat der Ice-Cap-Methode das Potenzial, eine Reihe von genetischen Experimenten, die sonst nicht sinnvoll sein, führen Sie erleichtern würde. Einige Beispiele sind unten angegeben.
- Genetic Mapping. Fine-Skala genetische Kartierung kann beschleunigt werden, wenn der Forscher in der Lage ist, um eine Rekombination Ereignisse innerhalb eines bestimmten Intervalls entlang der Chromosom 3 identifiziert werden. Wenn dieses Intervall mit einem sehr kurzen genetischen Distanz, dann die Rekombination Veranstaltungen werden relativ selten in der Trennung Mapping Bevölkerung. Aus diesem Grund kann es notwendig sein, um Bildschirm Tausende von einzelnen Pflanzen, um die gewünschte wieder findenrekombinante Individuen. Dieser Prozess könnte wesentlich durch den Einsatz von Ice-Cap beschleunigt werden. Auch im Zeitalter der Genom-weite Re-Sequenzierung, ist es noch notwendig, um direkt zu demonstrieren, dass eine bestimmte Mutation direkt verantwortlich für einen Phänotyp von Interesse ist. In diesen Fällen wird es notwendig sein, die interessierende Mutation weg zu trennen von anderen eng miteinander verknüpft Mutationen um zu beweisen, ein Kandidat Mutation tatsächlich ursächlich. In diesen Situationen würde Ice-Cap bieten eine effiziente Methode für das Brechen Verknüpfung zwischen einem Paar eng miteinander verbunden Mutationen.
- Multi-Mutanten. Es hat sich für die Forscher studieren Arabidopsis, um mutierte Allele von mehreren verschiedenen Loci in einer einzigen Person zu kombinieren, um funktionelle Redundanz 4-6 überwinden gemeinsam. Als Beispiel betrachten wir einen Fall, wo man wünscht, Mutanten-Allele aus vier verschiedenen Loci kombinieren in einer einzigen Pflanze durch genetische Kreuzung. Für dieses Projekt wird es notwendig sein, einen zu generierenn Person, heterozygot ist an diesen vier loci als Teil der Kreuzung Schema. Wenn diese Vierfach-heterozygote Sets Saatgut ist die vierfache homozygote voraussichtlich mit einer Rate von einem von 256 in der daraus resultierenden Population von Nachkommen präsentieren. Screening für diesen seltenen Einzelfällen mit herkömmlichen Methoden wäre ziemlich arbeitsintensiv. Im Vergleich dazu würde mit Ice-Cap für dieses Projekt der Wissenschaftler mit einer effizienten Strategie zur Identifizierung der seltenen Vierfach-Homozygoten in einer einzigen Generation bieten.
- iTILLING. Unser Labor kürzlich über einen neuen Ansatz zur Screening auf das Vorhandensein von induzierten Mutationen in Genen von Interesse in Arabidopsis 7. Diese Methode ist eine Variante einer etablierten Technik namens TILLING, dass wird verwendet, um Mutationen in geordneten Populationen von Individuen mit einem chemischen Mutagen 8-10 behandelt zu finden. Wir haben unsere Methode iTILLING genannt, weil es eine individualisierte Version des TILLING, dass ein ind erlaubt istividual Wissenschaftler zu erreichen etwas, das traditionell ein großes Forscherteam um komplette verlangt hat. Ice-Cap ist ein integraler Bestandteil der iTILLING Methode 7, wie unten beschrieben.
Die Idee hinter iTILLING ist eine ephemere mutierten Bevölkerung, die im Gegensatz zu den langlebigen Mutanten Bevölkerung für traditionelle TILLING Projekte erstellt steht zu produzieren. Für iTILLING werden die Samen aus einer bulked M2 Bevölkerung in 50 bis 100 Ice Cap Blöcken gesät, und die DNA extrahiert wird mit dem Ice-Cap-Verfahren. Arabidopsis-Keimlinge sind dann bei 4 ° C, während Mutations-Screening erfolgt mit dem Ice-Cap DNA preps. Tomatenjungpflanzen sind bei 12 ° C gelagert. Wenn Sämlinge tragen gewünschten Mutationen identifiziert worden sind, werden sie aus dem Ice-Cap Platten wiederhergestellt und an Boden. iTILLING ist nicht beabsichtigt, eine langfristige mutierten Bevölkerung für eine gesamte Forschung auf dem Bildschirm sorgen. Stattdessen bietet iTILLING eine Strategie, durch dieein Wissenschaftler kann eine benutzerdefinierte mutierten Bevölkerung auf Mutationen in einer Handvoll von Genen schnell Bildschirm, effizient und auf einem relativ niedrigen Kosten.
Wir haben Ice-Cap gefunden, um eine effektive Methode für den Anbau und die Genotypisierung Arabidopsis, Tomaten und Reis. Wir erwarten, dass andere Arten von Pflanzen sollte auch zugänglich sein Ice-Cap. Eine Einschränkung auf die Vielfalt der Arten, die von Ice-Cap untergebracht werden kann, ist die Größe der Samen. Nur Pflanzen mit Samen klein genug, um in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte fit ist kompatibel mit Ice-Cap in seiner jetzigen Konfiguration.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (Grant-Nummer MCB-0447750) gefördert.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
| ABgene Thermo-Sealer | ABgene USA | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
| Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
| MicroFill Microplate Dispenser | BioTek www.biotek.com |
AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
| Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
| Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
| 33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet |
| 30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
| Hose for fountain pump | Any lab supply company | Hose compatible with fountain pump | |
| Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
| Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Falcon www.bdbiosciences.com |
351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| 3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
| 3 inch Elastic hair bands | Local grocery store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
| 4 mm diameter wooden skewers | Local grocery store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
| Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
| Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
| Agar – cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
| Easy Peel heat sealing foil | ABgene USA | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
| Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd | OfficeMax www.officemax.com |
Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
| Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
| 96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
| Whatman Filter paper | Whatman International | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
| Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. |
References
- Clark, K. A., Krysan, P. J. Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0). Plant Methods. 3, 8-8 (2007).
- Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis. Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).
- Jander, G. Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).
- Liljegren, S. J. SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis. Nature. 404, 766-770 (2000).
- Buechel, S. Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration. Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).
- Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis. Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery. Plant J. 45, 684-694 (2006).
- Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).
Cite This Article
Su, S., Clark, K. A., Gibbs, N. M., Bush, S. M., Krysan, P. J. Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping. J. Vis. Exp. (57), e3280, doi:10.3791/3280 (2011).