Ice-Cap: Een methode voor het kweken Arabidopsis En tomatenplanten in 96-well platen voor high-throughput genotypering
Summary
De Ice-Cap-methode maakt het mogelijk om planten te kweken in 96-well platen en niet-destructieve oogst wortel weefsel van elke zaailing. DNA geëxtraheerd uit deze wortel weefsel kan worden gebruikt voor genotypering reacties. We hebben gevonden dat Ice-Cap goed werkt voor<em> Arabidopsis thaliana</em>, Tomaat en rijst zaailingen.
Abstract
Het wordt steeds vaker voor planten wetenschappers aan projecten die de genotypering van grote aantallen planten vereisen. De eerste stap in een genotypering project is om een weefsel te verzamelen van elke individuele plant. De traditionele benadering van deze taak is om te proeven planten een-op-een-keer. Als men wil genotype honderden of duizenden mensen, maar het gebruik van deze strategie resulteert in een belangrijk knelpunt in de genotypering pijplijn. De Ice-Cap methode die we beschrijven hier biedt een high-throughput oplossing voor deze uitdaging doordat een wetenschapper om weefsel te verzamelen van enkele duizenden zaailingen in een enkele dag 1,2. Dit niveau van de doorvoer wordt mogelijk gemaakt door het feit dat weefsel wordt geoogst uit planten 96-bij-een-time, in plaats van een-op-een-keer.
De Ice-Cap-methode biedt een geïntegreerd platform voor het uitvoeren van groei van zaailingen, weefsel oogst en DNA-extractie. De basis voor Ice-Cap is de groei van seedliNGS in een gestapelde paar van 96-wells platen. De putten van de bovenste plaat bevat stekkers van agar groei media waarop de individuele zaailingen ontkiemen. De wortels groeien naar beneden door de agar media, de bovenste plaat af te sluiten door middel van een gat, en gaan over in een onderplaat met water. Om de oogst weefsel voor DNA-extractie, het water in de onderste plaat met wortel weefsel snel bevroren, terwijl de zaailingen in de bovenste plaat blijven bij kamertemperatuur. De bovenste plaat wordt vervolgens uit de buurt van de onderste plaat geschild, waardoor een plaat met 96 wortel weefselmonsters bevroren in ijs en een plaat met 96 levensvatbaar zaailingen. De techniek is de naam "Ice-Cap", omdat het gebruik maakt van ijs vast te leggen de wortel weefsel. De 96-well plaat met de zaailingen kunnen dan verpakt in folie en overgebracht naar lage temperatuur. Dit proces opschort verdere groei van de zaailingen, maar heeft geen invloed op hun levensvatbaarheid. Zodra genotype analyse is afgerond, kan zaailingen met de gewenste genotype worden overgedragen van de 96-wells plaat de bodem voor verdere vermeerdering. We hebben aangetoond dat het nut van de Ice-Cap methode met behulp van Arabidopsis thaliana, tomaat en rijst zaailingen. We verwachten dat de methode ook moeten gelden voor andere soorten van planten met zaden klein genoeg om in de putjes van 96-wells platen.
Protocol
1. Bereid Ice-Cap Seedling Platen met Agar Growth Media Gesmolten groei media (0.5X Murashige en Skoog (MS) basale zout mengsel, 2 mM Morpholinoethanesulfonic zuur (MES), 0,6% agar (w / v), pH 5,7) wordt verdeeld in geautoclaveerd Zaailing platen met behulp van een MicroFill Microplate Dispenser. Een liter van de media nodig is per 18 Seedling platen. Bereid groei van media op een liter glazen flessen met schroefdop deksels en autoclaaf gedurende 20 minuten. Autoclaaf een liter gedestilleerd water in een glazen fles met schroefdeksel. Op hetzelfde moment ook de autoclaaf leeg Seedling Platen verpakt in aluminiumfolie. Breng de geautoclaveerd media en water om een incubator op 65 ° C. Deze temperatuur houdt de groei van media in een gesmolten toestand. Na de autoclaaf, verwijder Seedling Platen uit aluminiumfolie en plaats in de laminaire flow kap te drogen. Platen moeten volledig droog zijn voordat u verder gaat, zodat de zelfklevende tape kansluit de gaten aan de onderkant van de putten van de platen. Veeg lab bank met 95% ethanol om te saneren. Geniet van doorzichtige plastic deksels voor de Seedling platen in 95% ethanol te saneren. Verwijder de deksels van ethanol en lucht laten drogen in laminaire flow kap. Niet autoclaaf de plastic deksels om ze te steriliseren omdat ze smelten in de autoclaaf. Van toepassing verpakkingstape aan de onderkant van elke Seedling Plate en stevig afdichting met behulp van de roller tool. Plaats de flessen van gesmolten groei media en gesteriliseerd water in een waterbad op 65 ° C. Bevestig een fles met 70% ethanol bij kamertemperatuur tot de MicroFill machine en voer de purge cyclus twee keer aan het sanitair van de MicroFill machine ontsmetten. Bevestig de fles met steriel water om de MicroFill machine. Voer de purge cyclus zes keer naar het sanitair warm en duidelijk de ethanol uit het systeem. De fles van het water moet blijven in het 65 ° C bad tijdens de gehele procedure. Na het voltooien van de zuiveringen met steriel water, onmiddellijk bevestigen de fles van gesmolten groei media om de MicroFill machine. Voer de purge cyclus twee keer om het gedistilleerd water helder uit de leidingen. De fles van de groei media moeten blijven in het 65 ° C bad tijdens de gehele procedure. Doseer 450 microliter van de groei media in de putten van elk Seedling Plate. Werken snel, zodat de groei van media niet stollen in de leidingen van de MicroFill machine. Wanneer alle Seedling platen zijn gevuld, onmiddellijk bevestigen de fles van 65 ° C steriel water om de MicroFill machine en voer de purge cyclus 12 keer om de leidingen schoon te maken. De fles van het water moet blijven in het 65 ° C bad tijdens de gehele procedure. Als een MicroFill machine niet beschikbaar is, kan Seedling platen ook worden bereid door de hand-pipetteren gesmolten agar in de platen afgedicht met behulp van een multichannel pipet. Inspecteer de putten van elk Seedling platen to ervoor te zorgen dat de groei van media niet is gelekt uit een putten. Hand pipet extra gesmolten groei media in individuele putten als dat nodig is. Bedek elk bord met een doorzichtig plastic deksel, en laat de groei media te stollen in de Seedling platen bij kamertemperatuur. Stapel platen en wikkel in aluminiumfolie voor opslag bij 4 ° C. Store platen ondersteboven te water stapeling te voorkomen in de putjes tijdens de opslag. 2. Sow Seeds in Ice-Cap Seedling Platen en Ontkiemen Zaailingen We hebben eerder beschreven een semi-automatische methode voor het doseren van Arabidopsis zaden in Seedling platen met behulp van een zaadje laad-apparaat (2). Hoewel dit apparaat kan handig zijn voor sommige partijen zaad, hebben we gevonden dat de variabiliteit in zaad grootte weergegeven door verschillende charges van Arabidopsis zaden het algemene nut van dit apparaat beperkt. We zijn in het proces van het ontwikkelen van een alternatieve geautomatiseerde methode voor zaad doseren, BUt op dit moment hebben we gevonden dat de meest effectieve strategie voor het doseren van zaden in de Seedling Platen is om deze stap uit te voeren met de hand zoals hieronder beschreven. Strooi droge zaden op Whatman filtreerpapier. Doseer 95% ethanol op zaden, zodat alle van de zaden zijn bedekt met ethanol. Deze behandeling wordt het oppervlak Steriliseer de zaden. De zaden aan de lucht drogen. Transfer individuele zaden in de putjes van de Seedling platen met behulp van een gemodificeerde wegwerp glazen Pasteur pipet. Het einde van het Pasteur pipet wordt afgedicht door vlammende de tip. De resulterende glas tip wordt bevochtigd door voorzichtig te raken aan de agar media, die het mogelijk maakt een enkele zaden gemakkelijk worden opgepikt en overgebracht naar het oppervlak van de agar in de putjes van de Seedling Plate. Een dubbel-koppige versie van dit zaad plating tool kan ook gebruikt worden om de doorvoer te verhogen. Bedek elk Seedling Plate met een doorzichtig plastic deksel en afdichting met Micropore chirurgische tape. Wikkel de gestapelde platenmet aluminium folie en bewaar Arabidopsis zaden bij 4 ° C gedurende vier dagen de tijd om de zaden stratificeren en synchroniseren kieming. Tomatenzaad moeten worden opgeslagen in het donker bij 12 ° C gedurende vier dagen. Plaats de Seedling platen onder TL-licht bij 18 ° tot 20 ° C tot kieming te starten. 3. Overdracht Seedling Platen aan Ice-Cap Fountain Nadat de Seedling platen zijn onder lichte vier dagen, de overdracht van de Seedling platen om de Ice-Cap fontein. Voor Arabidopsis, zijn de zaailingen meestal links in de Ice Cap fontein voor 10 tot 14 dagen. Monteer de Ice-Cap Fountain door het plaatsen van een bakplaat op de top van de aangepaste rack structuur die is geplaatst in een plastic opbergdoos. Gebruik de waterpas moeren tot het niveau van de bakplaat aan te passen. Plaats een dompelpomp in de opslag doos en bevestig de afvoerslang van de pomp naar de zijkant van de bakplaat met behulp van een veer clamp. Monteer de Ice-Cap Fountain op een plank in de groei van de plant kamer of groeikamer, zodat het oppervlak van de Ice-Cap Fountain ontvangt direct tl-verlichting. Vul de Ice-Cap Fountain met een mengsel van 3 delen gedistilleerd water op 1 deel kraanwater. Water moet worden toegevoegd aan de fontein totdat de dompelpomp is enkele centimeters onder het waterniveau. Markeer de laatste waterpeil in de plastic opbergdoos met behulp van lab tape en een markering pen. Bereid Root Platen door het toevoegen van een 3/32-inch diameter roestvrij stalen bal aan elke well van een Root Plate. De roestvrij stalen kogels kunnen worden toegevoegd aan de Root Plates met behulp van een op maat gemaakte bal afgifte-inrichting 1. Dit apparaat is gemaakt door het plaatsen van een vel aluminiumfolie over het oppervlak van een 96-well PCR-plaat en het gebruik van een markering pen om de locaties van de centra van elk putje markering op het oppervlak van de folie. Dit betekende vel folie wordt dan geplaatst op de top van een extra 6 vellen aluminium vooril en rond het gladde oppervlak van een deksel van een gebruikte pipetpunt box. Een scherp voorwerp, zoals een houten stokje wordt vervolgens gebruikt om een graszode groot genoeg om een metalen bal te houden op elk van de 96 posities te creëren. In te vullen dit doseerinrichting met ballen, is een overmaat van metalen ballen uitgegoten over het apparaat en het is zachtjes geschud om overtollig ballen te verwijderen. De Root Plate wordt dan geplaatst op de top van de afgifte-inrichting, die is omgedraaid om een bal valt in elk putje van de Root Plate. Voeg 340 microliter van een mengsel van 3 delen gedistilleerd water op 1 deel kraanwater in elke well van de Root Plate met behulp van de MicroFill machine. Zorg ervoor dat de stalen ballen zijn toegevoegd aan de Root Plates voor het afgeven van de water. Verwijder het zelfklevende folie op de bodem van de Seedling platen en verwijder de doorzichtige plastic deksels van de platen. Plaats elke Zaailing Plate in een Root Plate met een metalen bal en water en samen veilig de twee platen met behulp van twee elastische hair bands. Plaats de gestapelde Ice-Cap platen in de Ice-Cap Fountain. De doorzichtige plastic deksels moeten niet worden gebruikt wanneer de platen in de Ice-Cap Fountain. Controleer of die goed A-01 van de Seedling plaat is uitgelijnd met een goed A-01 van de Root Plate. De gestapelde Seedling / Root platen moeten worden gelaten in de Ice-Cap fontein tot aan de meerderheid van de zaailingen hebben wortel weefsel dat is doorgedrongen in de Root Platen. De ideale temperatuur voor groei van Arabidopsis zaailingen in de Ice-Cap Fountain is ca. 18 ° C. Het waterpeil in de bakplaat moet zodanig zijn dat water kan stromen in de putjes van de Root platen, maar niet zo diep dat de zaailingen in de Seedling Plate zijn ondergedompeld. Als het waterniveau niet juist is moet u een andere bakplaat van de juiste diepte te krijgen. Periodiek toe te voegen gedestilleerd water aan de Ice-Cap Fountain naar het oorspronkelijke waterpeil behouden. Door de toevoeging van zuiver gedestilleerd water aan de fontein die u ter vervanging van devloeistof verloren door verdamping zonder dat de minerale samenstelling van het water in de fontein. Water niveau moet dagelijks in de Ice-Cap fontein worden gecontroleerd. 4. Oogst Root Tissue Root weefsel wordt geoogst door het bevriezen van het water in de Root Plate en dan het schillen van de Seedling Plate weg van de Root Plate. De dagen voor de oogst wortel weefsel, verwijder dan de gestapelde Ice-Cap platen uit de Ice-Cap Fountain. Plaats drie houten stokjes tussen de putten van de gestapelde Seedling en Root platen. Het doel van de spiesen is om de penpunten van de Seedling platen maken uit de bronnen van de Root platen ter voorbereiding van het invriezen. Laat de gestapelde Ice-Cap platen met houten spiesen gestoken om 's nachts staan onder lampen. Deze incubatie kan een lichte verdamping van de vloeistof in de Root platen, waarop de volgende invriezen en afstand tussen de platen processen faciliteert. Opde dag van weefsel oogst, bereiden een ijskoude bad. Plaats een 96-wells metaal thermisch blok in een pyrex schotel met mengsel van droog ijs en 95% ethanol. Laat de thermische blok naar de temperatuur equilibreren voor ca.. 20 minuten. Plaats de pyrex schaal op de top van een soort van isolerend materiaal, zoals een autoclaaf, zodat want dat de lage temperatuur niet het oppervlak van het lab bank beschadigen. Plaats de gestapelde Ice-Cap platen met de houten sateprikkers in de gekoelde thermische blok en incubeer gedurende 5 minuten. Gedurende deze tijd het water in de Root Plate zal bevriezen solide. De zaailingen in de Seedling Plaat niet bevriezen tijdens deze behandeling en blijven volledig levensvatbaar zijn. Verwijder de gestapelde Ice-Cap platen van de thermische blok en leg ze op het lab bank bij kamertemperatuur. Verwijder de elastische banden en de houten spiesen uit de gestapelde platen. Druk stevig op de bovenkant van de Seedling Plate om "kraken" van de platen. Vervolgens zorgvuldig verwijderen van de Root Plate en de Seedling Plate apart. Laat het water in de Root platen te ontdooien bij kamertemperatuur. Ontdooien kan worden versneld door het incuberen van de Root platen in een thermische blok ingesteld op 25 ° C. 5. Bewaar Seedling Plate bij lage temperatuur in the Dark Naar aanleiding van weefsel oogst, kan de zaailing platen worden opgeslagen in het donker bij lage temperatuur, die de levensvatbaarheid van de zaailingen te behouden terwijl genotype analyse wordt uitgevoerd. De zaailingen kunnen worden opgeslagen bij deze temperaturen gedurende enkele weken zonder de levensvatbaarheid. Na de oogst weefsel, seal het onderste deel van de zaailing plaat met plakband. Plaats een doorzichtig plastic deksel op de top van de Seedling Plate en veilig met microporiënvolume tape. Elkaar stapelen diverse Seedling Platen en wikkel in aluminiumfolie. Voor Arabidopsis zaailingen, plaats de platen bij 4 ° C. Voor tomaat zaailingen, plaats de platen bij 12 ° C. Zodra genotypering is voltooid, de SEedlings kan worden verwijderd uit deze lage temperatuur incubatie en overgeplant aan de bodem zoals hieronder beschreven. 6. DNA-extractie DNA geschikt voor PCR-reacties kunnen eenvoudig worden geëxtraheerd uit de wortel weefselmonsters. De opbrengst van het totale DNA hersteld van Arabidopsis wortel weefselmonsters is ca. 400 ng gemiddeld 2. Zorg ervoor dat het water in de Root platen volledig is ontdooid voor het uitvoeren van de DNA-extractie procedure. Inspecteer de platen om te bepalen of putten aanzienlijk minder water dan gemiddeld. Hand pipet gedestilleerd water in putten die extra water nodig. Gebruik de MicroFill machine tot 25 microliter van een Tris-EDTA-oplossing (500 mM Tris, pH 8, 50 mM EDTA, pH8) toe te voegen aan elke well van de Root platen. Sluit de putten van de Root platen met behulp van thermische afdichting folie en een warmte-sluitmachine. Plaats de verzegelde wortel platen op de GenoGrinder machine met deverzegelde het einde van de platen naar beneden. Deze plaat zorgt voor een optimale oriëntatie kraal beweging en voorkomt dat de kralen van steken in de putjes. Schud de platen in de GenoGrinder voor 3 ½ minuut op 1350 slagen per minuut. Breng de platen aan een centrifuge met microplaat carriers en draai de platen gedurende 10 minuten bij 3500 rpm bij 4 ° C om pellet de verpulverde wortel weefsel. De resulterende verdund extract bevat genomisch DNA die direct kunnen worden gebruikt in de PCR-reacties. Typisch een voegt twee microliter van dit DNA-extract om een PCR-reactie. Voor de opslag van DNA-monsters, sluit de microplaat met behulp van zelfklevende tape en plaats bij min 20 ° C. DNA-monsters kunnen worden opgeslagen voor een aantal maanden zonder duidelijke vermindering van de kwaliteit. 7. Transfer Zaailingen met de gewenste genotype voor in grond Zodra genotype analyse is voltooid, kunt zaailingen met de gewenste genotype worden overgeheveld van de SeedlingPlaten aan de bodem. Verwijder de Seedling Platen van koude-opslag en voor te bereiden potten met water verzadigde bodem mengsel. Voor het verwijderen van een individuele zaailing van de Seedling Plate, gebruik dan een tang waarmee een op de agar plug pakken, zonder het pletten van de zaailing. Pak de agar-plug met de tang en voorzichtig de agar stekker slide uit de Seedling Plate zorg dat u de zaailing schade. Als alternatief kan perslucht gebruikt worden om voorzichtig te schieten van de agar-plug en de zaailingen uit de put. Druk op de kleine gat in de bodem van de put tot aan de stekker naar buiten komt op het lab bank. Maak een klein gaatje in de bodem van de grootte van de agar stekker. Plaats de agar-plug in de grond en pak vochtige bodem rond de agar-stekker aan op de zaailing in de bodem veilig te stellen. Probeer niet om een van de agar te verwijderen uit de hele zaailing. Plaats de getransplanteerde zaailingen in een groei ruimte onder normale groeiomstandigheden. Dek de pot met een plastic deksel voor deeerste twee dagen na de transplantatie. Vervolgens verwijdert u het deksel en blijven de planten met behulp van standaard omstandigheden groeien. 8. Representatieve resultaten: Een voorbeeld van Arabidopsis zaailingen gegroeid met behulp van de Ice-Cap-systeem is weergegeven in Figuur 4A. Deze zaailingen was in de Ice-Cap fontein voor twee weken toen de foto werd genomen en waren klaar voor weefsel oogst. Root weefsel uit deze zelfde zaailing is weergegeven in figuur 4B. De totale hoeveelheid DNA geëxtraheerd uit een steekproef van de Arabidopsis wortel weefsel is typisch in het bereik van 100 tot 700 ng ng 2. Dit rendement berekening is gebaseerd op het gebruik van slechts een deel van de ruwe wortel extract. Omdat er slechts ca. 10% van de ruwe wortel extract wordt meestal gebruikt voor de DNA-extractie-proces, is het mogelijk om aanzienlijk meer genomisch DNA te verkrijgen voor downstream-analyse door het behoud van meer van het ruwe extract. Het totale bedrag van genomisch DNA verkregen met behulp van de Ice-Cap voldoende is om honderden van PCR reacties 2 uit te voeren. Figuur 1: Stroomdiagram van de Ice-Cap-proces. A) Seedling Plate met agar groei media waarop zaailingen ontkiemen. Wortels dringen de agar en te groeien naar beneden naar de onderkant van de plaat. Gaten in de onderkant van de putjes van de plaat worden afgedicht met zelfklevende folie. B) De Seedling Plate wordt gestapeld op de top van een Root Plate met water en een metalen bal. Roots exit de gaten in de bodem van de putten van de Seedling Plate en groeien in de putjes van de Root Plate. C) Houten spiesjes worden ingevoegd tussen de Seedling Plate en de Root Plate de dag voor de gestapelde Ice Cap platen worden geplaatst in een thermoblok in een droogijs / ethanol bad. D) Als het water in de Root Plate heeft bevroren, is de Seedling Plate weg geschild van de Root Plate, waardoor een Root Plaat met 96 weefselmonstersen een Seedling Plate met 96 levensvatbaar zaailingen. De houten stokjes vergemakkelijkt de scheiding van de twee platen tijdens deze stap. Figuur 2: Foto's van een Seedling Plate en een Root Plate. A) een zaailing Plate en een Root Plate los gezien. B) een zaailing Plate gestapeld op de top van een Root Plate. De stalen kogels worden gebruikt voor DNA-extractie kan worden gezien in de putjes van de Root Plate. Elastische banden worden gebruikt om samen te beveiligen de twee platen. Figuur 3: De Ice-Cap Fountain. De Ice-Cap Fountain wordt gebruikt om een constant waterniveau op de precieze hoogte van de toppen van de putten van de Root platen te behouden. Deze continue water systeem zorgt ervoor dat het water in de putten van de wortel platen niet geworden als gevolg van verdamping en transpiratie uitgeput. A) Een home-made rackdat ondersteunt de bakplaat waarop de gestapelde Ice-Cap platen zitten. B) Een close-up van een van de 1 "noten die een middel voor het exact aanpassen van het niveau van de bakplaat, zodat een uniforme waterdiepte wordt bereikt over het oppervlak van de fontein biedt. C) Deze afbeelding toont alle onderdelen die nodig zijn om de home-made rek voor een Ice-Cap-fontein. D) De verzamelde Ice-Cap fontein bouwen. Een dompelpomp fontein pomp constant water beweegt van het onderste reservoir om de cookie-plaat, die rust op de top van de home-made rek. Een slangklem wordt gebruikt om de slang hechten aan de rand van de bakplaat. Figuur 4: Arabidopsis zaailingen gegroeid met behulp van de Ice-Cap-proces. A) Bovenaanzicht op zoek naar beneden in twee putjes van een Seedling Plate. Elke well bevat een Arabidopsis zaailing. B) Zijaanzicht van twee putjes van een Root Plate. Roots kan worden gezien draaienrond de binnenkant van de putten. De zaailingen op deze foto was in de Ice-Cap Fountain voor ca.. twee weken en zijn op de groei fase waarin weefsel oogst normaal gesproken zou worden uitgevoerd.
Discussion
De Ice-Cap-methode hier gepresenteerde laat een wetenschapper om weefselmonsters te verzamelen van honderden of zelfs duizenden, van individuele planten in een enkele dag en efficiënt genomische DNA-extract van deze monsters voor gebruik in de genotypering reacties. Door het geven van een individuele wetenschapper de mogelijkheid om duizenden zaailingen genotype in een korte periode van tijd, de Ice-Cap-methode heeft het potentieel om een aantal genetische experimenten die anders niet zou praktisch zijn om uit te voeren te vergemakkelijken. Een aantal voorbeelden worden hieronder gegeven.
- Genetische Mapping. Fine-scale genetische mapping kan worden versneld als de onderzoeker in staat is om recombinatie gebeurtenissen te identificeren binnen een bepaald interval langs het chromosoom 3. Als dit interval gaat om een zeer korte genetische afstand, dan is de recombinatie gebeurtenissen zullen relatief zeldzaam zijn in de segregerende mapping bevolking. Om deze reden kan het nodig zijn om het scherm van duizenden individuele planten op de gewenste re vindenCombinant individuen. Dit kan aanzienlijk worden versneld door het gebruik van Ice-Cap. Zelfs in het tijdperk van de genoom-brede re-sequencing, is het nog steeds noodzakelijk is om direct aan te tonen dat een bepaalde mutatie is direct verantwoordelijk voor een fenotype van belang. In deze gevallen zal het nodig zijn om de mutatie van de rente af te scheiden van andere nauw met elkaar verbonden mutaties in om aan te tonen een kandidaat-mutatie is eigenlijk oorzakelijke. In deze situaties, zouden Ice-Cap bieden een efficiënte methode voor het verbreken koppeling tussen een paar nauw verbonden mutaties.
- Multi-mutanten. Het is gemeengoed geworden voor onderzoekers bestuderen van Arabidopsis aan mutant allelen van een aantal verschillende loci te combineren in een enkel individu om functionele redundantie 4-6 te overwinnen. Als voorbeeld, overweeg een zaak waar men wenst te mutante allelen combineren van vier verschillende loci in een enkele plant door middel van genetische kruising. Voor dit project, zal het nodig zijn om een te genererenn individu dat heterozygoot is op deze vier loci, als onderdeel van de kruising regeling. Wanneer deze quadruple-sets heterozygote zaad, is de viervoudige homozygote verwacht aanwezig te zijn bij een snelheid van een van de 256 in de resulterende populatie van nageslacht. Screening voor deze zeldzame individu door traditionele methoden zou nogal arbeidsintensief. Ter vergelijking, zou de wetenschapper met behulp van Ice-Cap voor dit project te voorzien van een efficiënte strategie voor het identificeren van de zeldzame quadruple homozygote in een enkele generatie.
- iTILLING. Ons laboratorium onlangs beschreef een nieuwe benadering voor screening op de aanwezigheid van de geïnduceerde mutaties in interessante genen in Arabidopsis 7. Deze methode is een variatie op een bestaande techniek genaamd Tilling die wordt gebruikt om mutaties vinden in geordende populaties van mensen die werden behandeld met een chemisch mutageen 8-10. We hebben onze methode iTILLING want het is een geïndividualiseerde versie van bewerken die het mogelijk maakt een individual wetenschapper iets dat traditioneel verplicht een groot onderzoeksteam in te vullen bereiken. Ice-Cap vormt een integraal onderdeel van de iTILLING methode 7, zoals hieronder beschreven.
Het idee achter iTILLING is het produceren van een kortstondige mutant bevolking, die staat in tegenstelling tot de duurzame populaties mutant gemaakt voor de traditionele bewerken projecten. Voor iTILLING, worden zaden van een bulk M2 bevolking gezaaid in 50 tot 100 Ice Cap blokken, en DNA wordt geëxtraheerd met behulp van de Ice-Cap-methode. Arabidopsis zaailingen worden dan geplaatst bij 4 ° C, terwijl mutatie screening is uitgevoerd met behulp van de Ice-Cap-DNA preps. Tomaat zaailingen worden bewaard bij 12 ° C. Zodra zaailingen uitvoeren gewenste mutaties zijn geïdentificeerd, worden ze hersteld van de Ice-Cap platen en overgebracht naar de bodem. iTILLING is niet bedoeld als een langdurige mutant bevolking voor een hele onderzoeksgemeenschap te voorzien om het scherm. In plaats daarvan, iTILLING biedt een strategie waarmeeeen wetenschapper kan het scherm een aangepaste mutant bevolking voor mutaties in een handvol genen snel, efficiënt en tegen een relatief lage kosten.
Wij hebben gevonden Ice-Cap aan een effectieve methode voor het kweken van en genotypering Arabidopsis, tomaat en rijst. We verwachten dat andere soorten van planten ook moet worden ontvankelijk voor Ice-Cap. Een beperking van de verscheidenheid van soorten die kunnen worden opgevangen door Ice-Cap is de grootte van de zaden. Alleen planten met zaden klein genoeg om in de putjes van een 96-wells plaat zal compatibel zijn met Ice-Cap in de huidige configuratie.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de National Science Foundation (subsidie aantal MCB-0447750).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
| ABgene Thermo-Sealer | ABgene USA | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
| Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
| MicroFill Microplate Dispenser | BioTek www.biotek.com |
AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
| Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
| Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
| 33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet |
| 30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
| Hose for fountain pump | Any lab supply company | Hose compatible with fountain pump | |
| Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
| Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Falcon www.bdbiosciences.com |
351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| 3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
| 3 inch Elastic hair bands | Local grocery store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
| 4 mm diameter wooden skewers | Local grocery store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
| Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
| Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
| Agar – cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
| Easy Peel heat sealing foil | ABgene USA | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
| Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd | OfficeMax www.officemax.com |
Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
| Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
| 96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
| Whatman Filter paper | Whatman International | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
| Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. |
References
- Clark, K. A., Krysan, P. J. Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0). Plant Methods. 3, 8-8 (2007).
- Krysan, P. I. c. e. -. c. a. p. A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis. Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).
- Jander, G. Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).
- Liljegren, S. J. SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis. Nature. 404, 766-770 (2000).
- Buechel, S. Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration. Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).
- Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis. Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery. Plant J. 45, 684-694 (2006).
- Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).
Cite This Article
Su, S., Clark, K. A., Gibbs, N. M., Bush, S. M., Krysan, P. J. Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping. J. Vis. Exp. (57), e3280, doi:10.3791/3280 (2011).