Ice Cap: Um Método para Crescer Arabidopsis Plantas e tomate em placas de 96 poços para High-Throughput Genotipagem
Summary
O método Ice Cap-permite cultivar plantas em placas de 96 poços e não-destrutiva do tecido raiz colheita de cada muda. DNA extraído dessa raiz tecido pode ser usado para reações de genotipagem. Descobrimos que Ice Cap-funciona bem para<em> Arabidopsis thaliana</em>, Tomate, mudas e arroz.
Abstract
Está se tornando comum para os cientistas de plantas para desenvolver projetos que requerem a genotipagem de grande número de plantas. O primeiro passo em qualquer projeto de genotipagem é coletar uma amostra de tecido de cada planta individual. A abordagem tradicional para essa tarefa é para as plantas uma amostra-at-a-tempo. Se alguém deseja centenas genótipo ou milhares de indivíduos, no entanto, usando esta estratégia resulta em um gargalo significativo no pipeline genotipagem. O método Ice Cap-que descrevemos aqui oferece uma solução de alto rendimento a este desafio, permitindo que um cientista para coletar o tecido de vários milhares de mudas em um único dia, 1,2. Este nível de vazão é tornada possível pelo fato de que o tecido é colhido a partir de plantas 96-at-a-tempo, ao invés de um-em-um-tempo.
O método Ice Cap-fornece uma plataforma integrada para a realização de um crescimento de mudas, a colheita de tecidos e extração de DNA. A base para Ice Cap-se o crescimento de seedlings em um par empilhadas de placas de 96 poços. Os poços da placa superior contêm fichas de ágar em que o crescimento de mudas individuais germinar. As raízes crescem para baixo através dos meios de ágar, sair da placa superior através de um buraco, e passar para uma água mais baixo da placa que contém. Para a colheita de tecidos para a extração de DNA, a água na parte inferior da placa contendo tecido raiz é rapidamente congelado, enquanto as mudas na placa superior permanecer em temperatura ambiente. A placa superior é, então, descoladas da placa inferior, resultando em um prato com 96 amostras de raízes tecido congelado em gelo e uma placa com 96 mudas viáveis. A técnica é chamada de "Ice Cap-" porque usa gelo para capturar o tecido radicular. A placa de 96 poços contendo as mudas pode, então, embrulhados em papel alumínio e transferidos para baixa temperatura. Este processo suspende um maior crescimento das mudas, mas não afeta a sua viabilidade. Pois a análise de genótipo foi concluída, as mudas com o genótipo desejado pode ser transferido do p de 96 poçostarde para o solo para a propagação ainda mais. Temos demonstrado a utilidade do método de Ice Cap-usando Arabidopsis thaliana, tomate, arroz e mudas. Esperamos que o método deve também ser aplicável a outras espécies de plantas com sementes pequenas o suficiente para caber nas cavidades da placas de 96 poços.
Protocol
1. Prepare Placas Ice Cap-Mudas com o Media Crescimento Agar Meio de crescimento fundido (0.5X Murashige e Skoog (MS) mistura de sal basal, 2 mM Morpholinoethanesulfonic ácido (MES), ágar 0,6% (w / v), pH 5,7) é dispensada em Placas de Mudas autoclavado utilizando um dispensador de microplacas micropartículas. Um litro de mídia é necessária por 18 Chapas de Mudas. Prepare a mídia de crescimento em uma garrafas de vidro litro com parafuso tampas superior e autoclave por 20 minutos. Autoclave um litro de água destilada em uma garrafa de vidro com tampa tampa de rosca. Ao mesmo tempo também autoclave Placas de Mudas vazio embrulhado em papel alumínio. Transferir a mídia autoclavada e água a um conjunto de incubadora a 65 ° C. Esta temperatura irá manter a media de crescimento em um estado fundido. Após autoclavagem, remover placas de mudas a partir de papel alumínio e coloque na capela de fluxo laminar para secar. Placas devem estar completamente secos antes de proceder para que a fita de embalagem adesivo podecompletamente selar os furos no fundo dos poços das placas. Limpe bancada de laboratório com etanol 95% para higienizar. Mergulhe claro tampas de plástico para as Placas de mudas em etanol 95% para higienizar. Remover as tampas a partir do etanol e do ar seco em capela de fluxo laminar. Não autoclave as tampas de plástico para esterilizá-los, porque eles vão derreter na autoclave. Aplicar a fita de embalagem para o fundo de cada placa de Mudas e firmemente selo usando a ferramenta de rolo. Coloque as garrafas de meio de crescimento líquido e água esterilizada em banho-maria regulado a 65 ° C. Anexar um frasco contendo etanol 70% à temperatura ambiente para a máquina de micropartículas e executar o ciclo de purga duas vezes para sanear o encanamento da máquina de micropartículas. Anexar a garrafa com água estéril para a máquina de micropartículas. Executar o ciclo de purga seis vezes para aquecer o encanamento e limpar o etanol a partir do sistema. A garrafa de água deve permanecer no banho 65 ° C durante todo este procedimento. Depois de completar os expurgos com água estéril, imediatamente anexar a garrafa de meio de crescimento de fundição para a máquina de micropartículas. Executar o ciclo de purga duas vezes para limpar a água destilada para fora do encanamento. A garrafa de meio de crescimento deve permanecer no banho 65 ° C durante todo este procedimento. Dispense 450 microlitros de meio de crescimento para os poços de cada placa de Mudas. Trabalhar rapidamente para que a mídia de crescimento não se solidifica no encanamento da máquina de micropartículas. Quando todas as placas de mudas foram preenchidos, imediatamente anexar a garrafa de água de 65 ° C estéril para a máquina de micropartículas e executar o ciclo de purga 12 vezes para limpar o encanamento. A garrafa de água deve permanecer no banho 65 ° C durante todo este procedimento. Se uma máquina de micropartículas não está disponível, placas de mudas também pode ser preparado por mão-de pipetagem agar derretido em que as placas seladas usando uma pipeta multicanal. Inspecionar os poços de cada t Placas de Mudaso garantir que a mídia de crescimento não vazou de um poço. Mão pipeta de mídia adicionais crescimento derretido em poços individuais, conforme necessário. Cubra cada prato com uma tampa de plástico transparente, e permitir meios de crescimento para solidificar nas placas de mudas à temperatura ambiente. Placas de pilha e embrulhe em papel alumínio para armazenamento a 4 ° C. Loja placas de cabeça para baixo para evitar acúmulo de água nos poços durante o armazenamento. 2. Semear em placas Ice Cap-Mudas e Sementes Germinar Nós já descreveu um método semi-automatizado para dispensar sementes de Arabidopsis em Placas de mudas utilizando um dispositivo de carga de sementes (2). Embora este dispositivo pode ser útil para alguns lotes de sementes, descobrimos que a variabilidade no tamanho das sementes exibidos por diferentes lotes de sementes de Arabidopsis limita a utilidade geral deste dispositivo. Estamos no processo de desenvolvimento de um método alternativo de distribuição automatizadas para semente, but no momento descobrimos que a estratégia mais eficaz para a distribuição de sementes para as Placas de mudas é para realizar esse passo a mão, como descrito abaixo. Polvilhe sementes secas em papel de filtro Whatman. Dispense etanol a 95% em sementes de modo que todas as sementes são cobertas com etanol. Este tratamento vai superfície esterilizar as sementes. Permitir que as sementes secar ao ar. Transferência de sementes individuais nos poços das Placas de mudas utilizando uma versão modificada descartáveis de vidro Pasteur pipeta. O fim da pipeta Pasteur é selada por chamas na ponta. A ponta de vidro resultante é umedecido por tocar suavemente para o ágar, que permite que um único sementes para ser facilmente capturada e transferida para a superfície do agar nos poços da placa de Mudas. A versão duas pontas desta ferramenta plating semente também pode ser usado para aumentar o rendimento. Cobrir cada Placa de mudas com uma tampa de plástico transparente e selo com esparadrapo micropore. Enrole as placas empilhadascom folha de alumínio e sementes Arabidopsis armazenar a 4 ° C por quatro dias para estratificar as sementes e sincronizar a germinação. Sementes de tomate deve ser armazenado no escuro a 12 ° C por quatro dias. Coloque as placas de mudas sob luz fluorescente de 18 ° a 20 ° C para iniciar a germinação. 3. Transferência Placas de Mudas para Ice Cap-Fonte Após as Placas de mudas foram sob a luz durante quatro dias, a transferência das placas de mudas para a fonte Ice Cap-. Para Arabidopsis, as mudas são normalmente deixadas no chafariz Cap Ice por 10 a 14 dias. Monte da Fonte Ice Cap-colocando uma assadeira em cima da estrutura de rack costume que foi colocado dentro de uma caixa de armazenamento de plástico. Use as porcas de nivelamento para ajustar o nível da folha de cookie. Coloque uma bomba submersível na caixa de armazenamento e anexar a mangueira de saída da bomba para o lado da assadeira usando uma mola clamp. Monte da Fonte Ice Cap-em uma prateleira na sala de crescimento da planta ou câmara de crescimento a fim de que a superfície da Fonte Ice Cap-recebe iluminação fluorescente direta. Preencha a Fonte Ice Cap-com uma mistura de 3 partes de água destilada para uma água de torneira parte. A água deve ser adicionada à fonte até que a bomba submersível é de vários centímetros abaixo do nível da água. Marque o nível da água final na caixa de armazenamento de plástico com fita de laboratório e uma caneta de marcação. Prepare Placas Root, adicionando uma 3/32-inch diâmetro da esfera de aço inoxidável para cada poço de uma placa de raiz. As bolas de aço inoxidável podem ser adicionados às placas Root usando uma custom made bola dispositivo de distribuição 1. Este dispositivo é feita colocando uma única folha de papel alumínio sobre a superfície de uma placa de 96 poços PCR e usando uma caneta para marcar a localização dos centros de cada poço na superfície da folha. Esta folha marcada de folha é então colocada em cima de um adicional de 6 folhas de alumínio parail e envolto em torno da superfície lisa de uma tampa de uma caixa utilizada pipeta ponta. A ferramenta afiada como um espeto de madeira é então utilizado para criar um torrão grande o suficiente para segurar uma bola de metal única em cada uma das 96 posições. Para preencher este dispositivo de distribuição com bolas, um excesso de bolas de metal é derramado sobre o dispositivo e é agitada suavemente para remover excesso de bolas. A Placa Root é então colocado sobre a parte superior do dispositivo de distribuição, que é virado para soltar uma bola em cada poço da placa de raiz. Adicione 340 microlitros de uma mistura de 3 partes de água destilada para 1 parte água de torneira a cada poço da placa Root usando a máquina de micropartículas. Certifique-se que as bolas de aço foram adicionadas às placas Root antes de dispensar a água. Descasque o filme adesivo fora da parte inferior das Placas de Mudas e remover as tampas de plástico das placas. Coloque cada placa de mudas em uma Placa Root contendo uma bola de metal e água e segura as duas placas em conjunto, utilizando dois hai elásticar bandas. Coloque o gelo empilhadas Cap-placas na Fonte Ice Cap-. As tampas de plástico transparente não deve ser usado quando as placas estão no Fountain Ice Cap-. Certifique-se de que o bem A-01 da Placa de mudas é bem alinhado com A-01 da Placa Root. O empilhados Mudas / Root As placas devem ser deixados na Fonte Ice Cap-até que a maioria das mudas têm tecido de raiz que penetrou as Placas de raiz. A temperatura ideal para o crescimento de mudas Arabidopsis na Fonte Ice Cap-se ca. 18 ° C. O nível de água na assadeira deve ser tal que a água pode fluir nos poços das placas de raiz, mas não tão profunda que as mudas na Placa de Mudas estão submersos. Se o nível da água não é correto que você vai precisar de ter uma folha de cookie diferente da profundidade correta. Adicionar água destilada periodicamente para a Fonte Ice Cap-para manter o nível de água original. Por adição de água destilada pura da fonte que você irá substituir olíquidos perdidos devido à evaporação, sem alterar a composição mineral da água na fonte. Nível da água deve ser verificada diariamente na Fonte Ice Cap-. 4. Tecido Root colheita Tecidos da raiz é colhida através do congelamento de água na Placa Root e depois descascar a Placa de Mudas de distância da placa de raiz. O dia antes da colheita de tecidos da raiz, remova a empilhados Ice Cap-Placas da Fonte Ice Cap-. Inserir três espetos de madeira entre as cavidades da Seedling placas empilhadas e Raiz. O objetivo do espetos é elevar o nibs das Placas de mudas fora dos poços das Placas Root em preparação para o processo de congelamento. Permitir que a empilhados Ice Cap-Placas com espetos de madeira inserida para repousar durante a noite sob as luzes. Esta incubação permite a evaporação do líquido leve nas placas de raiz, o que facilita o congelamento subsequente e processos de separação de placas. Emo dia da colheita de tecido, prepare um banho de congelamento. Coloque um bloco de metal de 96 poços térmica em um prato pirex com mistura de gelo seco e etanol 95%. Permitir que o bloco térmico para equilibrar na temperatura de ca. De 20 minutos. Coloque o pirex em cima de algum tipo de material isolante, como uma luva autoclave para que a temperatura baixa não danificar a superfície da bancada do laboratório. Coloque o gelo empilhadas Cap-placas com os espetos de madeira no bloco refrigerados térmica e incubar por 5 minutos. Durante este tempo a água na Placa Root irá congelar sólidos. As mudas na Placa de mudas não congelar durante este tratamento e permanecem totalmente viável. Remover o gelo empilhadas Cap-chapas do bloco térmico e colocá-los na bancada do laboratório à temperatura ambiente. Retire os elásticos e os espetos de madeira das placas empilhadas. Pressione firmemente para baixo sobre o topo da placa de mudas de "quebrar" as placas. Então, cuidadosamente casca da Prata Raiz ea Placa de Mudas apart. Permitir que a água nas placas de Root para descongelar em temperatura ambiente. Descongelamento pode ser acelerado pela incubação das placas de raiz em um bloco térmico fixado em 25 ° C. 5. Loja Placa de mudas em baixa temperatura in the Dark Após a colheita de tecidos, as placas de mudas podem ser armazenadas no escuro em temperatura baixa, o que irá manter a viabilidade das mudas, enquanto análise do genótipo é executada. As mudas podem ser armazenados nestas temperaturas por várias semanas sem afetar a viabilidade. Após a colheita de tecidos, selar a parte inferior da placa de mudas com fita adesiva. Coloque uma tampa de plástico transparente em cima da placa de Mudas e segura com fita micropore. Pilha de placas de mudas diversas juntas e embrulhe em papel alumínio. Para mudas de Arabidopsis, coloque as placas a 4 ° C. Para mudas de tomate, coloque as placas a 12 ° C. Uma vez que a genotipagem é completa, a SEedlings pode ser removido desta incubação à temperatura baixa e transplantadas para o solo, conforme descrito abaixo. 6. Extração de DNA DNA adequada para reações de PCR pode ser facilmente extraído das amostras de tecidos da raiz. O rendimento de DNA total recuperado de amostras de tecido de Arabidopsis raiz é ca. 400 ng, em média, 2. Certifique-se que a água nas placas Root completamente descongelados antes de executar o procedimento de extração de DNA. Inspecionar as placas para determinar se algum poços têm água substancialmente inferiores à média. Pipeta mão destilada água em poços que necessitam de água adicional. Use a máquina de micropartículas para adicionar 25 microlitros de uma solução de Tris-EDTA (500 mM Tris, pH 8, 50 mM EDTA, PH8) a cada poço das placas de raiz. Vedação dos poços das Placas Root usando folha de selagem térmica e uma máquina de selagem a quente. Coloque as placas de raiz selado na máquina GenoGrinder com ofinal selada das placas voltado para baixo. Esta orientação placa fornece movimento talão ideal e evita as contas de degola nos poços. Agitar as placas na GenoGrinder por 3 minutos e meio em 1350 golpes por minuto. Transferir os pratos para uma centrífuga com as operadoras de microplacas e girar as placas por 10 minutos a 3500 RPM a 4 ° C a pelota o tecido da raiz pulverizada. O extrato resultante diluída contém DNA genômico que pode ser usado diretamente em reações de PCR. Tipicamente um vai adicionar 2 microlitros do extrato de DNA para uma reação de PCR. Para o armazenamento de amostras de DNA, selar a microplaca com fita adesiva de embalagem e local em menos 20 ° C. Amostras de DNA podem ser armazenados durante vários meses, sem aparente redução na qualidade. 7. Mudas de transferência com o genótipo desejado para o solo Quando a análise é o genótipo completo, mudas com o genótipo desejado pode ser transferido do SeedlingPlacas para o solo. Remova as placas de Mudas de armazenamento a frio e preparar panelas com água saturada de mistura do solo. Para remover um indivíduo de mudas da Prata Seedling, use uma pinça que permite pegar a ficha de agar sem esmagar a muda. Pegar a ficha de ágar com a pinça e deslize o plug agar para fora da placa de mudas com cuidado para não danificar as mudas. Alternativamente, o ar pressurizado pode ser usado para disparar gentilmente o plug ágar e mudas para fora do poço. Aplicar pressão ao pequeno furo no fundo do poço até a ficha saia para a bancada do laboratório. Prepare um pequeno buraco no solo do tamanho do plugue do ágar. Coloque o plugue agar no solo e embalar solo úmido ao redor do plug-agar para garantir a muda no solo. Não tente remover qualquer uma das agar em torno da muda. Coloque as mudas transplantadas em sala de crescimento sob condições de crescimento normais. Tampe a panela com uma tampa de plástico para adois primeiros dias após o transplante. Posteriormente, remover a tampa e continuar a crescer as plantas utilizando condições padrão. 8. Resultados representativos: Um exemplo de mudas de Arabidopsis cresceu usando o sistema de Ice Cap-é mostrado na Figura 4A. Essas mudas foram na fonte Ice Cap-há duas semanas quando a foto foi tirada e estavam prontos para a colheita de tecidos. Tecidos da raiz destas mudas mesmo é mostrado na Figura 4B. A quantidade total de DNA extraído de uma amostra de tecido da raiz Arabidopsis é tipicamente na faixa de 100 a 700 ng ng 2. Este cálculo de rendimento é baseado no uso de apenas uma porção do extrato de raiz de crude. Porque só ca. 10% do extrato bruto da raiz é normalmente utilizado para o processo de extração de DNA, é possível obter DNA genômico significativamente mais para a análise a jusante retendo mais do extrato bruto. A quantidade total de DNA genômico obtidos com o Ice-Processo de limitação é suficiente para executar centenas de reações de PCR 2. Figura 1: Fluxograma do processo de Ice Cap-. A) Placa de Mudas contendo ágar em que o crescimento de mudas germinam. Raízes penetram no agar e crescer em direcção ao fundo do prato. Buracos no fundo dos poços da placa são selados com filme adesivo. B) A Placa de mudas é empilhados em cima de uma água contendo Placa Root e uma bola de metal. Raízes de saída dos furos no fundo dos poços da placa de Mudas e crescer no cavidades da Placa Root. C) espetos de madeira são inseridas entre a Placa de Mudas e da Prata Root no dia anterior as placas empilhadas Ice Cap são colocados em uma termobloco em um banho de gelo / etanol seco. D) Uma vez que a água na Placa Root tem congelado, a Placa de mudas é descascado longe da Placa Root, produzindo uma Placa de Raiz com 96 amostras de tecidoe uma Placa de mudas com 96 mudas viáveis. Os espetos de madeira facilitar a separação das duas placas durante esta etapa. Figura 2: Fotografias de uma Placa de Mudas e uma Placa de raiz. A) A Placa de Mudas e uma placa Root visto separadamente. B) A Placa de Mudas empilhados em cima de uma placa de raiz. As bolas de aço utilizado para a extração de DNA pode ser visto nos poços da placa de raiz. Faixas elásticas são usadas para proteger as duas placas em conjunto. Figura 3: The Fountain Ice Cap-. The Fountain Ice Cap-é usado para manter um nível constante de água na altura exata dos topos dos poços das Placas Root. Este sistema de rega contínua garante que a água nos poços das placas de raiz não se esgotam devido à evaporação ou transpiração. A) A home-made de rackque suporta a assadeira em que o gelo empilhadas Cap-Placas sentar. B) Um close-up de um dos 1 "porcas que fornece um meio para ajustar com precisão o nível da assadeira para que a lâmina d'água uniforme é obtido através da superfície da fonte. C) Esta imagem mostra todos os peças necessárias para construir o home-made rack para uma fonte de gelo Cap-. D) O montado Fountain Ice Cap-. Uma bomba submersível fonte constantemente se move a água do reservatório inferior para a folha de cookie, que repousa no topo da home-made rack. Um grampo de mola é usado para conectar a mangueira à borda da assadeira. Figura 4: Arabidopsis mudas cultivadas utilizando o processo de Ice Cap-. A) Vista de cima olhando para baixo em dois poços de uma placa de Mudas. Cada poço contém uma muda Arabidopsis. B) Vista lateral de dois poços de uma placa de raiz. Raízes podem ser vistos torçãoem torno da superfície interna dos poços. As mudas nesta foto tinha sido na Fonte Ice Cap-para ca. duas semanas e estão em fase de crescimento, onde a colheita de tecido, normalmente, seria realizada.
Discussion
O método Ice Cap-apresentada aqui permite que um cientista para coletar amostras de tecido de centenas ou mesmo milhares, de plantas individuais em um único dia e eficiente extrair o DNA genômico das amostras para uso em reações de genotipagem. Dando um cientista individual a capacidade de genótipo milhares de mudas em um curto período de tempo, o método Ice Cap-tem o potencial para facilitar uma série de experiências genéticas que não seriam práticos para executar. Vários exemplos são fornecidos abaixo.
- Mapeamento genético. Numa escala de mapeamento genético pode ser acelerada se o pesquisador é capaz de identificar eventos de recombinação dentro de um intervalo específico ao longo do cromossomo 3. Se este intervalo envolve uma distância muito curta genética, então os eventos de recombinação será relativamente raros na população de mapeamento segregação. Por esta razão, pode ser necessário para milhares de tela de plantas individuais para encontrar a desejada reindivíduos combinant. Este processo pode ser bastante acelerada com a utilização de Ice Cap-. Mesmo na era do genoma re-seqüenciamento, é ainda necessário demonstrar diretamente que uma mutação é diretamente responsável por um fenótipo de interesse. Nestes casos, será necessário segregar as mutações de interesse longe de outras mutações intimamente ligada a fim de provar uma mutação candidato é realmente causador. Nestas situações, Ice Cap-se proporcionar um método eficiente para a quebra de ligação entre um par de mutações intimamente ligados.
- Multi-mutantes. Tornou-se comum para pesquisadores que estudam Arabidopsis para combinar alelos mutantes de vários loci distintos em um único indivíduo, a fim de superar a redundância funcional 4-6. Como exemplo, considere um caso em que se deseja combinar alelos mutantes de quatro loci diferentes em uma única planta por meio de cruzamento genético. Para este projeto, será necessário para gerar umn indivíduo que é heterozigoto para estas quatro loci como parte do esquema de cruzamento. Quando isso quadruple-heterozigoto semente sets, o homozigoto quadruple é esperado para estar presente a uma taxa de um em cada 256 na população resultante da progênie. Triagem para essa pessoa rara pelos métodos tradicionais seria muito trabalhoso. Por comparação, usando Ice Cap-para este projeto proporcionaria o cientista com uma estratégia eficiente para identificar o homozigoto rara quadruplicar em uma única geração.
- iTILLING. Nosso laboratório descreveu recentemente uma nova abordagem para screening para a presença de mutações induzidas em genes de interesse em 7 Arabidopsis. Este método é uma variação de uma técnica estabelecida chamado Tilling que é usado para localizar mutações em populações ordenada de indivíduos tratados com um agente mutagénico química 8-10. Nós chamamos nosso método iTILLING porque é uma versão individualizada de cultivo que permite que um indcientista ividual para realizar algo que tradicionalmente tem exigido uma equipe de pesquisa grande para ser concluído. Ice Cap-faz parte integrante do método iTILLING 7, conforme descrito abaixo.
A idéia por trás iTILLING é produzir uma população mutante efêmera, que contrasta com as populações duráveis mutante criado para projetos de Tilling tradicionais. Para iTILLING, sementes de uma população bulked M2 são semeadas em 5-10 blocos Ice Cap, e DNA é extraído utilizando o método de Ice Cap-. Arabidopsis mudas são então colocadas a 4 ° C, enquanto triagem de mutação é realizada utilizando o DNA Ice Cap- preps. Mudas de tomate são armazenadas a 12 ° C.. Uma vez que mudas de portadores de mutações desejadas tenham sido identificadas, elas são recuperadas das placas Ice Cap-e transferidos para o solo. iTILLING não se destina a fornecer uma população mutante de longa duração para uma comunidade de pesquisa toda a tela. Em vez disso, iTILLING fornece uma estratégia pela qualum cientista pode tela de uma população mutante personalizado para mutações em um punhado de genes com rapidez, eficiência e com um custo relativamente baixo.
Foram encontradas Ice Cap-de ser um método eficaz para o cultivo e genotipagem Arabidopsis, tomate e arroz. Esperamos que outras espécies de plantas devem também ser passíveis de Ice Cap-. Uma limitação na variedade de espécies que podem ser acomodados por Ice-Cap é o tamanho das sementes. Apenas as plantas com sementes pequenas o suficiente para caber em poços de uma placa de 96 poços será compatível com Ice Cap-na sua configuração actual.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma bolsa da National Science Foundation (conceder número MCB-0447750).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
| ABgene Thermo-Sealer | ABgene USA | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
| Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
| MicroFill Microplate Dispenser | BioTek www.biotek.com |
AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
| Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
| Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
| 33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet |
| 30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
| Hose for fountain pump | Any lab supply company | Hose compatible with fountain pump | |
| Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
| Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Falcon www.bdbiosciences.com |
351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| 3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
| 3 inch Elastic hair bands | Local grocery store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
| 4 mm diameter wooden skewers | Local grocery store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
| Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
| Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
| Agar – cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
| Easy Peel heat sealing foil | ABgene USA | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
| Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd | OfficeMax www.officemax.com |
Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
| Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
| 96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
| Whatman Filter paper | Whatman International | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
| Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. |
References
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Cite This Article
Su, S., Clark, K. A., Gibbs, N. M., Bush, S. M., Krysan, P. J. Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping. J. Vis. Exp. (57), e3280, doi:10.3791/3280 (2011).