Ice-Cap: un procédé de croissance Arabidopsis Et plants de tomates dans des plaques à 96 puits pour génotypage à haut débit
Summary
La méthode calotte permet de cultiver des plantes en plaques à 96 puits et non destructive tissu racinaire de récolte de chaque plant. L'ADN extrait à partir de ce tissu racinaire peut être utilisé pour des réactions de génotypage. Nous avons constaté que la calotte glaciaire fonctionne bien pour les<em> Arabidopsis thaliana</em>, La tomate, les plants de riz.
Abstract
Il est devenu courant pour les scientifiques des plantes pour développer des projets qui nécessitent le génotypage d'un grand nombre de plantes. La première étape de tout projet de génotypage est de collecter un échantillon de tissu de chaque plante. L'approche traditionnelle de cette tâche est de plantes échantillon de un en un temps. Si l'on veut à des centaines ou des milliers de génotypes particuliers, cependant, l'utilisation de ce résultat stratégie dans un goulot d'étranglement important dans le pipeline de génotypage. La méthode la calotte glaciaire que nous décrivons ici fournit une solution haut-débit à ce défi en permettant à un chercheur de collecter des tissus de plusieurs milliers de plants dans un seul jour 1,2. Ce niveau de débit est rendue possible par le fait que le tissu est récolté à partir de plantes de 96 en un temps, plutôt que d'une moins-un-temps.
La méthode la calotte glaciaire offre une plate-forme intégrée pour effectuer la croissance des semis, la récolte des tissus, et l'extraction d'ADN. La base de la calotte glaciaire est la croissance de seedliNGS dans une paire empilée de plaques à 96 puits. Les puits de la plaque supérieure contiennent les bouchons de gélose de milieu de croissance sur lequel plants individuels germer. Les racines poussent vers le bas à travers les médias d'agar, sortie de la plaque supérieure par un trou, et de passer dans une eau contenant la plaque inférieure. Pour la récolte de tissus pour l'extraction d'ADN, de l'eau dans la plaque inférieure contenant les tissus des racines est rapidement congelé alors que les semis dans la plaque supérieure rester à température ambiante. La plaque supérieure est ensuite décollé de la plaque inférieure, ce qui donne une plaque avec 96 échantillons de tissu racinaire dans la glace et une plaque avec 96 plants viables. La technique est appelée "Ice-Cap», car il utilise de la glace pour capturer le tissu racinaire. La plaque 96 puits contenant les plantules peuvent ensuite enveloppés dans du papier et transférés à basse température. Ce processus suspend une nouvelle croissance des plants, mais n'affecte pas leur viabilité. Une fois l'analyse du génotype a été achevé, les jeunes plants avec le génotype désiré peut être transférée de la p 96 puitsfin à la terre pour la multiplication ultérieure. Nous avons démontré l'utilité de la méthode de la calotte glaciaire à l'aide d'Arabidopsis thaliana, la tomate, et les semis de riz. Nous prévoyons que la méthode doit également être applicable à d'autres espèces de plantes à graines assez petit pour tenir dans les puits de plaques à 96 puits.
Protocol
1. Préparer les plaques de semis calotte glaciaire avec des médias de croissance Agar Milieux de croissance Molten (0.5X Murashige et Skoog (MS) mélange de sel gris, 2 mM d'acide Morpholinoethanesulfonic (MES), l'agar 0,6% (p / v), pH 5,7) est dispensée dans les assiettes des semis autoclave utilisant un distributeur de microplaques MicroFill. Un litre de médias est nécessaire pour 18 plaques de semis. Préparer les milieux de croissance dans un litre de bouteilles en verre avec des couvercles à vis en haut et l'autoclave pendant 20 minutes. Autoclave d'un litre d'eau distillée dans une bouteille en verre avec couvercle à vis. Dans le même temps aussi l'autoclave Plaques de semis vides enveloppées dans du papier aluminium. Transfert des médias à l'autoclave et l'eau à un incubateur réglé à 65 ° C. Cette température sera de maintenir des milieux de croissance à l'état fondu. Après autoclavage, enlever les plaques de semis à partir de feuilles et les placer dans une hotte à flux laminaire à sec. Les plaques doivent être complètement sec avant de procéder de telle sorte que le ruban d'emballage adhésif peutsceller complètement les trous sur le fond des puits des plaques. Essuyez paillasse avec de l'éthanol à 95% pour désinfecter. Tremper claires couvercles en plastique pour les plaques de semis dans de l'éthanol à 95% pour désinfecter. Enlever les couvercles de l'éthanol et l'air sec dans une hotte à flux laminaire. Ne pas autoclaver les couvercles en plastique pour les stériliser, car ils vont fondre dans l'autoclave. Appliquer du ruban d'emballage au fond de chaque assiette semis et fermement joint à l'aide de l'outil rouleau. Placez les bouteilles de milieux de croissance fondu et l'eau stérilisée dans un bain d'eau réglé à 65 ° C. Fixez une bouteille contenant de l'éthanol 70% à la température ambiante à la machine MicroFill et exécuter le cycle de purge deux fois pour assainir la plomberie de la machine MicroFill. Fixez la bouteille avec de l'eau stérile pour la machine MicroFill. Exécuter le cycle de purge six fois pour réchauffer la plomberie et claire de l'éthanol en dehors du système. La bouteille de l'eau doit rester dans le bain à 65 ° C tout au long de cette procédure. Après avoir terminé les purges à l'eau stérile, fixer immédiatement le flacon de milieu de croissance liquide à la machine MicroFill. Exécuter le cycle de purge deux fois pour effacer l'eau distillée de la plomberie. La bouteille de milieux de croissance devraient rester dans le bain à 65 ° C tout au long de cette procédure. Distribuer 450 microlitres de milieu de croissance dans les puits de chaque plaque de semis. Travaillez rapidement afin que les milieux de croissance ne se solidifie pas dans la plomberie de la machine MicroFill. Lorsque toutes les plaques de semis ont été remplis, fixer immédiatement la bouteille de 65 ° C l'eau stérile à la machine MicroFill et exécuter le cycle de purge 12 fois pour nettoyer la tuyauterie. La bouteille de l'eau doit rester dans le bain à 65 ° C tout au long de cette procédure. Si une machine MicroFill n'est pas disponible, Plaques de semis peuvent aussi être préparés à la main-pipetage gélose fondue dans les plaques scellées à l'aide d'une pipette multicanaux. Inspectez les puits de plaques de semis chaque to s'assurer que les milieux de croissance n'a pas filtré de tout puits. Main la pipette multimédia supplémentaire de croissance en fusion dans des puits individuels au besoin. Couvrir chaque plaque avec un couvercle en plastique transparent, et permettre aux médias de solidifier la croissance dans les plaques de semis à température ambiante. Plaques de la pile et l'envelopper dans du papier d'aluminium pour le stockage à 4 ° C. Plaques magasin à l'envers pour éviter l'accumulation d'eau dans les puits pendant le stockage. 2. Semez les graines dans des assiettes semis calotte glaciaire et des plants germer Nous avons précédemment décrit une méthode semi-automatisée pour la distribution de graines d'Arabidopsis en plaques de semis en utilisant un dispositif de chargement de graines (2). Bien que ce dispositif peut être utile pour certains lots de semences, nous avons constaté que la variabilité de la taille des graines affichées par les différents lots de graines d'Arabidopsis limite l'utilité générale de ce dispositif. Nous sommes dans le processus d'élaboration d'une méthode alternative pour les semences de distribution automatisé, but à l'heure actuelle, nous avons constaté que la stratégie la plus efficace pour la distribution des semences dans les plaques de semis est de réaliser cette étape à la main comme décrit ci-dessous. Saupoudrer de graines sécher sur papier filtre Whatman. Distribuer l'éthanol à 95% sur les graines de sorte que toutes les graines sont recouvertes avec de l'éthanol. Ce traitement de surface de stériliser les graines. Laisser les semences sécher à l'air. Transfert des graines individuelles dans les puits des plaques de semis en utilisant une modification jetables pipette Pasteur en verre. L'extrémité de la pipette Pasteur est scellé à la flamme de la pointe. La pointe de verre qui en résulte est humidifié en touchant doucement à l'agar, qui permet à une seule des graines pour être facilement repris et transférés à la surface de l'agar-agar dans le puits de la plaque de semis. Une version à double tête de cet outil de plaquage de semences peuvent également être utilisés pour augmenter le débit. Couvrir chaque plaque de semis avec un couvercle en plastique transparent et sceller avec du ruban chirurgical Micropore. Envelopper les plaques empiléesavec du papier aluminium et les graines d'Arabidopsis conserver à 4 ° C pendant quatre jours pour stratifier les graines et de synchroniser la germination. Graines de tomates doivent être stockés dans l'obscurité à 12 ° C pendant quatre jours. Placer les plaques de semis sous un éclairage fluorescent à 18 ° à 20 ° C pour initier la germination. 3. Transfert des semis à des plaques de glace-Cap Fontaine Après que les plaques de semis ont été sous la lumière pendant quatre jours, le transfert des plaques de semis à la fontaine de glace-Cap. Pour Arabidopsis, les plants sont habituellement laissés dans la fontaine de Cap glace pendant 10 à 14 jours. Assembler la fontaine de la calotte glaciaire en plaçant une plaque à biscuits sur le dessus de la structure de support personnalisé qui a été placée dans une boîte de rangement en plastique. Utilisez la noix de nivellement pour ajuster le niveau de la tôle à biscuits. Placer une pompe submersible dans la zone de stockage et de fixer le tuyau de sortie de la pompe sur le côté de la plaque à biscuits en utilisant un ressort CLAmp. Assembler la fontaine de la calotte glaciaire sur une étagère dans la salle de la croissance des plantes ou de la chambre de croissance afin que la surface de la fontaine de la calotte glaciaire reçoit directement la lumière fluorescente. Remplissez la fontaine de la calotte glaciaire avec un mélange de 3 parties d'eau distillée pour une eau du robinet partie. L'eau devrait être ajoutée à la fontaine jusqu'à la pompe submersible est de quelques centimètres en dessous du niveau d'eau. Marquer le niveau d'eau final dans la boîte de rangement en plastique avec du ruban de laboratoire et un marqueur. Préparer les plaques de racine en ajoutant une boule de diamètre en acier inoxydable 3/32-inch à chaque puits d'une plaque de racine. Les billes en acier inoxydable peut être ajouté à la racine de plaques personnalisées en utilisant une boule faite dispositif de distribution 1. Cet appareil est fait en plaçant une seule feuille de papier d'aluminium sur la surface d'une plaque de 96 puits PCR et en utilisant un marqueur pour marquer les emplacements des centres de chaque puits sur la surface de la feuille. Cette feuille de papier marqués est ensuite placé sur le dessus d'un supplémentaire de 6 feuilles d'aluminium pour lesIL et enroulé autour de la surface lisse d'un couvercle d'une boîte de pointe de la pipette utilisée. Un outil pointu tel une brochette en bois est alors utilisé pour créer un divot assez grand pour contenir une bille métallique unique à chacun des 96 postes. Pour combler ce dispositif de distribution avec des boules, un excès de billes de métal est versé sur le périphérique et il est agité doucement pour enlever l'excès boules. La plaque de racine est ensuite placé sur le dessus du dispositif de distribution, qui est retourné à la chute d'un ballon dans chaque puits de la plaque Root. Ajouter 340 microlitres d'un mélange de 3 parties d'eau distillée pour une eau du robinet dans chaque puits de la plaque root en utilisant la machine MicroFill. Assurez-vous que les billes d'acier ont été ajoutés à la racine de plaques avant de distribuer l'eau. Pelez le film adhésif du fond des plaques de semis et enlever les couvercles en plastique transparent à partir des plaques. Placez chaque plaque de semis dans une plaque de racine contenant une bille de métal et l'eau et sécuriser les deux plaques en utilisant deux hai élastiquesbandes R. Placez la glace empilée-Cap plaques dans la fontaine de la calotte glaciaire. Les couvercles en plastique transparent ne doit pas être utilisé lorsque les plaques sont dans la fontaine de la calotte glaciaire. Assurez-vous que le bien A-01 de la plaque de semis est aligné avec et A-01 de la plaque Root. Le empilés semis / Root Les plaques doivent être laissés dans la fontaine de la calotte glaciaire jusqu'à la majorité des plants ont tissu racinaire qui a pénétré dans les plaques de Racine. La température de croissance idéale pour les semis d'Arabidopsis dans la fontaine de la calotte glaciaire est d'env. 18 ° C. Le niveau d'eau dans la feuille de biscuit doit être telle que l'eau peut s'écouler dans le puits des plaques de Racine, mais pas si profond que les semis dans la plaque de semis sont submergés. Si le niveau d'eau n'est pas correct, vous aurez besoin d'obtenir une tôle à biscuits différents de la bonne profondeur. Ajouter de l'eau distillée périodiquement à la fontaine de glace-Cap à maintenir le niveau d'eau initial. En ajoutant l'eau distillée pure de la fontaine, vous remplacez laliquides perdus à cause de l'évaporation sans changer la composition minérale de l'eau dans la fontaine. Le niveau d'eau doit être contrôlé quotidiennement dans la fontaine de la calotte glaciaire. 4. Tissu racinaire Moisson Tissu racinaire est récolté par congélation de l'eau dans l'assiette racine, puis peler la plaque de semis loin de la plaque Root. Le jour avant la récolte des tissus des racines, enlever la glace empilée-Cap Plaques de la fontaine de la calotte glaciaire. Insérez trois brochettes de bois entre les puits de la plantule empilés et plaques Root. Le but de la brochette est de sensibiliser les plumes des plaques de semis hors des puits des plaques de racine en préparation pour le processus de congélation. Autoriser l'empilés calotte Plaques avec des brochettes de bois inséré au repos une nuit sous les lumières. Cette incubation permet une légère évaporation du liquide dans les plaques de racine, ce qui facilite le gel ultérieur et les procédés de séparation plaque. Surjour de la récolte des tissus, préparer un bain de congélation. Placez un bloc de métal de 96 puits thermique dans un plat en pyrex avec un mélange de glace sèche et 95% d'éthanol. Laisser le bloc thermique de s'équilibrer en température pour ca. 20 minutes. Placer le plat en pyrex sur le dessus d'un certain type de matériau isolant tel qu'un autoclave mitaines de telle sorte que la basse température n'a pas endommager la surface de la paillasse. Placez la glace empilée-Cap plaques avec les brochettes de bois dans le bloc refroidi thermique et incuber pendant 5 minutes. Pendant ce temps l'eau dans l'assiette Racine va geler dur. Le semis à la plaque de semis ne pas congeler pendant ce traitement et restent parfaitement viables. Retirez la calotte glaciaire empilés plaques du bloc thermique et les placer sur la paillasse à température ambiante. Retirez les bandes élastiques et les brochettes de bois à partir des plaques empilées. Appuyez fermement sur le haut de la plaque semis à "craquer" les plaques. Puis détachez soigneusement la plaque de la racine et la plaque de semis APl'art. Laisser l'eau dans les plaques racine pour décongeler à température ambiante. La décongélation peut être accélérée par l'incubation des plaques racine dans un bloc thermique réglé à 25 ° C. 5. Boutique Plaque de semis à basse température dans le noir Après la récolte des tissus, les plaques de semis peuvent être stockés dans l'obscurité à basse température qui va maintenir la viabilité des plants alors que l'analyse du génotype est effectuée. Les plants peuvent être stockées à ces températures pendant plusieurs semaines sans affecter la viabilité. Après la récolte des tissus, sceller la partie inférieure de la plaque de semis avec du ruban adhésif. Placez un couvercle en plastique transparent sur le dessus de la plaque de semis et sécurisé avec du ruban adhésif microporeux. Stack Plaques de semis de plusieurs ensemble et envelopper dans du papier aluminium. Pour les semis d'Arabidopsis, placer les plaques à 4 ° C. Pour les semis de tomate, placer les plaques à 12 ° C. Une fois que le génotypage est terminée, le soiedlings peut être retiré de cette incubation à basse température et transplantées sur le sol tel que décrit ci-dessous. 6. Extraction de l'ADN ADN appropriées pour les réactions PCR peut être facilement extrait de la racine des échantillons de tissus. Le rendement de l'ADN total récupéré des échantillons de tissus d'Arabidopsis root est ca. 400 ng en moyenne 2. Assurez-vous que l'eau dans les plaques Racine a complètement décongelés avant d'effectuer la procédure d'extraction d'ADN. Inspecter les plaques afin de déterminer si les puits ont beaucoup moins d'eau que la moyenne. Pipette à la main de l'eau distillée dans des puits qui ont besoin d'eau supplémentaire. Utilisez la machine MicroFill d'ajouter 25 microlitres d'une solution de Tris-EDTA (500 mM Tris, pH 8, 50 mM d'EDTA, pH8) à chaque puits des plaques de racine. Sceller le puits des plaques de racine en utilisant une feuille d'étanchéité thermique et une machine de thermoscellage. Placez les assiettes profondes scellés sur la machine avec le GenoGrinderextrémité scellée des plaques vers le bas. Cette orientation de plaque offre optimale et empêche le mouvement perle des perles de coller dans les puits. Agiter les plaques dans le GenoGrinder pour 3 minutes et demie à 1350 coups par minute. Transfert des plaques à une centrifugeuse avec des supports de microplaques et de spin les plaques pendant 10 minutes à 3500 rpm à 4 ° C pour culotter les tissus racinaires pulvérisé. L'extrait résultant diluée contient l'ADN génomique qui peut être directement utilisé dans les réactions PCR. Généralement, on va ajouter deux microlitres de cet extrait d'ADN à une réaction de PCR. Pour le stockage des échantillons d'ADN, joint la microplaque à l'aide de ruban adhésif d'emballage et placer à moins 20 ° C. Les échantillons d'ADN peuvent être stockés pendant plusieurs mois sans réduction apparente de qualité. 7. Transfert plantules avec génotype voulu au sol Une fois l'analyse du génotype est terminée, les jeunes plants avec le génotype désiré peut être transférée de la plantulePlaques au sol. Retirez les plaques de semis de la chambre froide et de préparer les pots avec un mélange de terre saturée d'eau. Pour supprimer un semis individuels de la plaque de semis, utilisez une pince qui permet de récupérer le bouchon de gélose sans écraser les semis. Prenez le bouchon de gélose avec la pince et faites glisser doucement le bouchon de gélose de la plaque de semis en faisant attention de ne pas endommager les jeunes plants. Alternativement, l'air pressurisé peut être utilisé pour tirer doucement le bouchon de gélose et de semis hors du puits. Appliquer une pression sur le petit trou dans le fond du puits jusqu'à la prise ressorte sur le banc de laboratoire. Préparer un petit trou dans le sol de la taille du bouchon de gélose. Placez le bouchon de gélose dans le sol et de l'emballage sol humide autour du bouchon de gélose pour sécuriser le plant dans le sol. Ne pas tenter de retirer tout de l'agar de partout dans le semis. Placez les plants transplantés dans une chambre de croissance dans des conditions de croissance standard. Couvrir la casserole avec un couvercle en plastique pour lales deux premiers jours après la greffe. Par la suite enlever le couvercle et continuer à cultiver les plantes en utilisant des conditions standard. 8. Les résultats représentatifs: Un exemple de plants d'Arabidopsis cultivées en utilisant le système de la calotte glaciaire est montré dans la figure 4A. Ces plants avaient été dans la fontaine de glace-Cap pendant deux semaines quand la photo a été prise et nous étions prêts pour la récolte des tissus. Tissu racinaire de ces plantules même est montré dans la figure 4B. Le montant total de l'ADN extrait d'un échantillon de tissu racinaire d'Arabidopsis est typiquement de l'ordre de 100 ng à 700 ng 2. Ce calcul de rendement est basé sur l'utilisation d'une seule partie de l'extrait de racine de brut. Parce que ca. 10% de l'extrait de racine de brut est généralement utilisé pour le processus d'extraction d'ADN, il est possible d'obtenir l'ADN génomique beaucoup plus pour l'analyse aval en retenant plus de l'extrait brut. Le montant total de l'ADN génomique obtenue en utilisant la glaceProcédure de Cap est suffisant pour effectuer des centaines de réactions PCR 2. Figure 1: Diagramme du processus de la calotte glaciaire. Plaque de semis A) contenant un milieu de croissance de gélose sur laquelle les semis germent. Racines pénètrent l'agar-agar et grandir vers le fond de la plaque. Des trous dans le fond des puits de la plaque sont scellées avec un film adhésif. B) la plaque de semis sont empilés sur une plaque d'eau contenant des racines et une boule de métal. Racines de sortie des trous dans le fond des puits de la plaque de semis et de grandir dans le puits de la plaque Root. C) les brochettes de bois sont insérés entre les plaques de semis et la plaque de la racine de la journée avant que les plaques empilées calotte glaciaire sont placés dans un thermobloc dans une glace sèche / éthanol bain. D) Une fois l'eau dans l'assiette Racine a gelé, la plaque de semis est décollée de la plaque de la racine, ce qui donne une plaque Racine avec 96 échantillons de tissuset une plaque de semis avec 96 plants viables. Les brochettes de bois de faciliter la séparation des deux plaques au cours de cette étape. Figure 2: Photographies d'une plaque de semis et une plaque de Racine. A) une plaque de semis et une plaque de Racine vus séparément. B) une plaque de semis empilés sur une plaque de Racine. Les billes d'acier utilisées pour l'extraction de l'ADN peut être vu dans le puits de la plaque Root. Les bandes élastiques sont utilisés pour sécuriser les deux plaques ensemble. Figure 3: La fontaine de glace-Cap. La fontaine de glace-Cap est utilisée pour maintenir un niveau d'eau constant à la hauteur précise des sommets des puits des plaques de Racine. Ce système d'arrosage en continu garantit que l'eau dans les puits des plaques de la racine ne s'épuisent en raison de l'évaporation ou transpiration. A) Une maison en rackqui soutient la feuille de biscuit sur lequel la glace empilée-Cap Plaques s'asseoir. B) Une vue rapprochée de l'un des 1 "noix qui fournit un moyen pour justement régler le niveau de la feuille de cookie afin que d'une profondeur uniforme de l'eau est réalisée à travers la surface de la fontaine. C) Cette image affiche l'ensemble des les pièces nécessaires pour construire la maison rack pour une fontaine de glace-Cap. D) Les assemblées calotte Fontaine. Une pompe submersible fontaine se déplace constamment l'eau du réservoir inférieur vers la plaque à biscuits, qui repose sur le dessus de la maison rack. Une pince à ressort est utilisé pour attacher le tuyau au bord de la tôle à biscuits. Figure 4: plants d'Arabidopsis cultivées en utilisant le processus de la calotte glaciaire. A) Vue de dessus regardant vers le bas en deux puits d'une plaque de semis. Chaque puits contient une plantule d'Arabidopsis. Vue latérale B) de deux puits d'une plaque de racine. Les racines peuvent être vus tordreautour de la surface intérieure du puits. Le semis sur cette photo avait été dans la fontaine de la calotte glaciaire pour ca. deux semaines et sont au stade de croissance où la récolte des tissus seraient normalement exécutés.
Discussion
La méthode calotte présentée ici permet à un chercheur pour recueillir des échantillons de tissus provenant de centaines, voire des milliers, des plantes individuelles en une seule journée et efficace d'extraire l'ADN génomique à partir de ces échantillons pour une utilisation dans les réactions de génotypage. En donnant un scientifique de la capacité de déterminer le génotype des milliers de plants dans un court laps de temps, la méthode la calotte glaciaire a le potentiel pour faciliter un certain nombre d'expériences génétiques qui autrement ne seraient pas pratiques à réaliser. Plusieurs exemples sont fournis ci-dessous.
- Cartographie génétique. Beaux échelle de cartographie génétique peut être accéléré si le chercheur est en mesure d'identifier les événements de recombinaison dans un intervalle précis le long du chromosome 3. Si cet intervalle implique une très courte distance génétique, puis les événements de recombinaison sera relativement rare dans la population de cartographie de ségrégation. Pour cette raison, il peut être nécessaire à des milliers d'écran de plantes individuelles pour trouver le nouveau désiréCombinant les individus. Ce processus pourrait être grandement accéléré par l'utilisation de la calotte glaciaire. Même à l'ère du génome entier de re-séquençage, il est encore nécessaire de démontrer que directement une mutation donnée est directement responsable d'un phénotype d'intérêt. Dans ces cas, il sera nécessaire de séparer la mutation d'intérêt au détriment d'autres mutations étroitement liées, afin de prouver une mutation candidat est effectivement responsable. Dans ces situations, la calotte glaciaire pourrait fournir une méthode efficace pour briser lien entre une paire de mutations étroitement liées.
- Multi-mutants. Il est devenu commun pour les chercheurs qui étudient Arabidopsis pour combiner des allèles mutants de plusieurs loci distincts en un seul individu, afin de surmonter la redondance fonctionnelle 4-6. À titre d'exemple, considérons un cas où l'on souhaite combiner des allèles mutants de quatre loci différents dans une seule plante par croisement génétique. Pour ce projet, il sera nécessaire de générer uneParticulier N qui est hétérozygote à ces quatre loci dans le cadre du régime de passage. Lorsque cette graine quadruple hétérozygote ensembles, l'homozygote quadruple est prévu d'être présent à un taux de un sur 256 dans la population résultant de la descendance. Préalable de cette personne rare par les méthodes traditionnelles serait très laborieux. Par comparaison, en utilisant la calotte glaciaire pour ce projet permettrait au scientifique une stratégie efficace pour identifier les homozygotes rares quadrupler en une seule génération.
- iTILLING. Notre laboratoire a récemment décrit une nouvelle approche pour le dépistage de la présence de mutations induites dans les gènes d'intérêt dans 7 Arabidopsis. Cette méthode est une variation sur une technique bien établie appelée TILLING qui est utilisé pour trouver des mutations dans des populations commandé des individus traités avec un mutagene chimique 8-10. Nous avons nommé notre méthode iTILLING parce qu'il s'agit d'une version personnalisée de TILLING qui permet une indchercheur ividual pour accomplir quelque chose qui a traditionnellement exigé une grande équipe de recherche à compléter. Ice-Cap fait partie intégrante de la méthode iTILLING 7, tel que décrit ci-dessous.
L'idée derrière iTILLING est de produire une population éphémère mutant, qui est en contraste avec les populations durables mutant créé pour les projets traditionnels TILLING. Pour iTILLING, les graines d'une population en vrac M2 sont semées en 50 100 blocs Ice Cap, et l'ADN est extrait en utilisant la méthode des calottes glaciaires. Plants d'Arabidopsis sont ensuite placés à 4 ° C, alors que le dépistage de mutation est réalisée en utilisant l'ADN calotte glaciaire preps. Plants de tomates sont conservés à 12 ° C. Une fois les plantules présentant des mutations désirées ont été identifiés, ils sont récupérés à partir des plaques de glace-Cap et transféré au sol. iTILLING n'est pas destiné à fournir une population durable mutantes pour une communauté de recherche entier à l'écran. Au lieu de cela, iTILLING fournit une stratégie par laquelleun scientifique peut filtrer une population mutante personnalisées pour des mutations dans une poignée de gènes rapidement, efficacement et à un coût relativement faible.
Nous avons trouvé calotte glaciaire d'être une méthode efficace pour la croissance et le génotypage d'Arabidopsis, la tomate et du riz. Nous prévoyons que d'autres espèces de plantes devraient également se prêter à calotte glaciaire. Une limite à la variété des espèces qui peuvent être logés par Ice-Cap est la taille des graines. Seules les plantes avec des graines assez petit pour tenir dans le puits d'une plaque de 96 puits sera compatible avec la calotte glaciaire dans sa configuration actuelle.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par une subvention de la National Science Foundation (numéro de subvention MCB-0447750).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
| ABgene Thermo-Sealer | ABgene USA | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
| Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
| MicroFill Microplate Dispenser | BioTek www.biotek.com |
AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
| Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
| Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
| 33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet |
| 30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
| Hose for fountain pump | Any lab supply company | Hose compatible with fountain pump | |
| Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
| Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Falcon www.bdbiosciences.com |
351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| 3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
| 3 inch Elastic hair bands | Local grocery store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
| 4 mm diameter wooden skewers | Local grocery store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
| Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
| Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
| Agar – cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
| Easy Peel heat sealing foil | ABgene USA | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
| Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd | OfficeMax www.officemax.com |
Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
| Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
| 96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
| Whatman Filter paper | Whatman International | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
| Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. |
References
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Cite This Article
Su, S., Clark, K. A., Gibbs, N. M., Bush, S. M., Krysan, P. J. Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping. J. Vis. Exp. (57), e3280, doi:10.3791/3280 (2011).